| High-throughput Microscopic Analysis of Salmonella Invasion of Host Cells
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Author:
Date:
2018-09-20
[Abstract] Salmonella is a Gram-negative bacterium causing a gastro-enteric disease called salmonellosis. During the first phase of infection, Salmonella uses its flagella to swim near the surface of the epithelial cells and to target specific site of infection. In order to study the selection criteria that determine which host cells are targeted by the pathogen, and to analyze the relation between infecting Salmonella (i.e., cooperation or competition), we have established a high-throughput microscopic assay of HeLa cells sequentially infected with fluorescent bacteria. Using an automated pipeline of image analysis, we quantitatively characterized a multitude of parameters of infected and non-infected cells. Based on this, we established a predictive model that ...
[摘要] 沙门氏菌是革兰氏阴性细菌，引起称为沙门氏菌病的胃肠疾病。在感染的第一阶段，沙门氏菌使用其鞭毛在上皮细胞表面附近游泳并靶向特定的感染部位。为了研究确定哪种宿主细胞被病原体靶向的选择标准，并分析感染沙门氏菌（ ie ，合作或竞争）之间的关系，我们有建立了对荧光细菌依次感染的HeLa细胞的高通量显微镜检测。使用自动化图像分析管道，我们定量表征了感染和未感染细胞的众多参数。基于此，我们建立了一个预测模型，使我们能够识别宿主细胞易受感染的参数。我们发现宿主细胞易损性有两个来源：病原体诱导的细胞易感性从沙门氏菌摄取中出现并持续存在于感染过程的后期阶段;以及与细胞固有属性相关的宿主细胞固有的脆弱性，例如局部细胞拥挤和胆固醇含量。我们的方法基于形态学或分子宿主细胞参数预测单层上皮细胞中沙门氏菌感染的概率。在这里，我们提供了工作流程的详细描述，包括基于计算机的分析管道。我们的方法有可能应用于研究宿主 - 病原体相互作用的其他组合。
【背景】鼠伤寒沙门氏菌血清型鼠伤寒沙门氏菌通过摄入受污染的食物或水感染宿主，引起沙门氏菌病。一旦细菌到达肠道的远端回肠，它们就会侵入广泛的宿主细胞，包括肠上皮细胞（Watson和Holden，2010）。在宿主细胞入侵的第一阶段，沙门氏菌选择其目标，使用其鞭毛游泳并扫描上皮表面（Misselwitz et ...
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| Induction of Natural Competence in Genetically-modified Lactococcus lactis
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Author:
Date:
2018-07-05
[Abstract] Natural competence can be activated in Lactoccocus lactis subsp lactis and cremoris upon overexpression of ComX, a master regulator of bacterial competence. Herein, we demonstrate a method to activate bacterial competence by regulating the expression of the comX gene by using a nisin-inducible promoter in an L. lactis strain harboring either a chromosomal or plasmid-encoded copy of nisRK. Addition of moderate concentrations of the inducer nisin resulted in concomitant moderate levels of ComX, which led to an optimal transformation rate (1.0 x 10-6 transformants/total cell number/g plasmid DNA). Here, a detailed description of the optimized protocol for competence induction is presented.
[摘要] 在过度表达细菌能力的主要调节因子ComX后，天然能力可以在乳酸乳球菌亚种乳酸和 cremoris 中激活。 在本文中，我们展示了通过在 L中使用乳链菌肽诱导型启动子调节 comX 基因的表达来激活细菌能力的方法。 含有 nisRK 的染色体或质粒编码拷贝的lactis 菌株。 加入中等浓度的诱导剂乳链菌肽导致伴随的中等水平的ComX，其导致最佳转化率（1.0×10 2 sup / -6>转化子/总细胞数/ g质粒DNA）。 在此，提出了用于能力归纳的优化协议的详细描述。
【背景】自然能力是细菌通过专门的摄取机制获得外源DNA的过程，之后内化的DNA整合到其基因组中或作为质粒DNA维持。一些细菌在特定的环境触发因素如基因毒性应激或饥饿时进入能力状态（Seitz和Blokesch，2013; Blokesch，2016）。群体感应系统，如 comCDE 或 comRS ，控制着革兰氏阳性菌的自然能力的激活（Håvarstein et al。，1995; Pestova et al。，1996; Kleerebezem et al。，1997b; Fontaine et al。，2015）。更具体地说， comC 和 comS 编码信息素，而 comD 编码组氨酸激酶和 comE 和 comR 编码响应调节器（Håvarstein et al。，1995; ...
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| Targeted Genome Editing of Virulent Phages Using CRISPR-Cas9
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Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] This protocol describes a straightforward method to generate specific mutations in the genome of strictly lytic phages. Briefly, a targeting CRISPR-Cas9 system and a repair template suited for homologous recombination are provided inside a bacterial host, here the Gram-positive model Lactococcus lactis MG1363. The CRISPR-Cas9 system is programmed to cleave a specific region present on the genome of the invading phage, but absent from the recombination template. The system either triggers the recombination event or exerts the selective pressure required to isolate recombinant phages. With this methodology, we generated multiple gene knockouts, a point mutation and an insertion in the genome of the virulent lactococcal phage p2. Considering the broad host range of the plasmids used ...
[摘要] 该协议描述了一个直接的方法来产生严格裂解噬菌体的基因组中的特定突变。 简而言之，在细菌宿主（此处为革兰氏阳性模型乳酸乳球菌MG1363）内提供靶向CRISPR-Cas9系统和适合于同源重组的修复模板。 CRISPR-Cas9系统被编程为切割入侵噬菌体的基因组上存在的特定区域，但是缺少重组模板。 该系统触发重组事件或施加分离重组噬菌体所需的选择性压力。 利用这种方法，我们在毒性乳酸球菌噬菌体p2的基因组中产生了多个基因敲除，点突变和插入。 考虑到本协议中使用的质粒的广泛宿主范围，后者可以外推到其他噬菌体 - 宿主对。
【背景】噬菌体是在每个生态系统中发现丰富的细菌病毒（Suttle，2005; Breitbart and Rohwer，2005），毫不奇怪，它们是牛奶的天然居民。噬菌体p2是乳品工业中发现的强毒乳球菌噬菌体的最普遍组（ Sk1virus ）的模型（Deveau等人，2006; Mahony等人。，2012），它感染革兰氏阳性细菌乳酸乳球菌MG1363，也是基础研究的模式菌株。尽管p2作为参照噬菌体的地位，但几乎一半的基因编码未表征的蛋白质。同样，由宏基因组学确定的绝大多数噬菌体基因在公共数据库中没有功能分配和同系物（Hurwitz等人，2016; Paez-Espino等人， 2016）。
研究基因的方法之一是通过修饰和随后观察所得到的表型。噬菌体基因组只能在宿主内以其生物活性形式进行修饰。强毒噬菌体严格裂解;因此，它们的基因组从未整合到细菌染色体中。这为DNA的体内修饰增加了一个时间限制，只能在短的感染周期内对其进行操作。 ...
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