| Conditional Knockdown of Proteins Using Auxin-inducible Degron (AID) Fusions in Toxoplasma gondii
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Author:
Date:
2018-02-20
[Abstract] Toxoplasma gondii is a member of the deadly phylum of protozoan parasites called Apicomplexa. As a model apicomplexan, there is a great wealth of information regarding T. gondii’s 8,000+ protein coding genes including sequence variation, expression, and relative contribution to parasite fitness. However, new tools are needed to functionally investigate hundreds of putative essential protein coding genes. Accordingly, we recently implemented the auxin-inducible degron (AID) system for studying essential proteins in T. gondii. Here we provide a step-by-step protocol for examining protein function in T. gondii using the AID system in a tissue culture setting.
[摘要] 弓形虫是原生动物寄生虫称为Apicomplexa致命门的一员。 作为一个复杂的模型，关于T的信息有很多。 gondii的8,000多种蛋白质编码基因，包括序列变异，表达和对寄生虫适应的相对贡献。 然而，需要新的工具来功能性地调查数百个推定的必需蛋白质编码基因。 因此，我们最近实施了生长素诱导降解（AID）系统来研究T中的基本蛋白质。弓形虫。 在这里，我们提供了一个检查蛋白质功能的一步一步的协议。 在组织培养环境中使用AID系统。
【背景】生长素是一类通过靶向某些蛋白质在植物中进行蛋白酶体降解而发出信号的植物激素（Teale等人，2006）。 Kohei Nishimura等人具有将该植物特异性信号传导系统的组分转移到其他真核生物中用于有兴趣的蛋白质（POI）的条件调节，创建生长素诱导降解（AID）系统的聪明想法（Nishimura等人，2009）。这个系统已经被成功地用于几种真核生物，包括疟原虫疟原虫（Kreidenweiss et al。，2013; Philip和Waters，2015）。只需要两个转基因成分来实现这个系统，称为转运抑制剂反应1（TIR1）的植物生长素受体和用AID标记的POI。用生长素（例如，3-吲哚乙酸/ IAA）处理活化SCF ...
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| Actin Retrograde Flow in Permeabilized Cells: Myosin-II Driven Centripetal Movement of Transverse Arcs
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Author:
Date:
2016-03-05
[Abstract] Numerous biological functions such as cytokinesis, changes in cell shape and cell migration require actomyosin-driven cellular contractility. However, the detailed mechanism of how contractile forces drive cellular processes are difficult to decipher due to the complexity of the intracellular environment. In particular, the mesoscopic description of the myosin II-dependent actin retrograde flow in cell lamellum is missing. Here, we describe a methodology for detergent extraction of cell, which preserves integrity of the actin cytoskeleton. This semi-in vitro cell model allows for the observation, using light microscopy, and quantification of changes in the actin cytoskeleton resulting from the activation of cellular contractility upon addition of ATP. This assay also allows for ...
[摘要] 许多生物学功能如细胞分裂，细胞形状和细胞迁移的变化需要肌动蛋白驱动的细胞收缩性。然而，由于细胞内环境的复杂性，收缩力如何驱动细胞过程的详细机制难以解读。特别是，细胞层中的肌球蛋白II依赖性肌动蛋白逆行流的介观描述缺失。在这里，我们描述了洗涤剂提取的细胞，保留肌动蛋白细胞骨架的完整性的方法。这种半体外细胞模型允许使用光学显微镜观察和定量在添加ATP时由于细胞收缩性的活化而导致的肌动蛋白细胞骨架中的变化。该测定还允许评估肌动蛋白相关蛋白和其他相关因子在肌动蛋白收缩活性的调节中的作用。在这里，我们证明逆行流动的着名的基于肌动蛋白的结构 - 横向弧，这是肌球蛋白IIA含有结构出现在lamellipodium-lamellum之间的边界和肌球蛋白II依赖的方式向心移动。
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