| A Streamlined Method for the Preparation of Growth Factor-enriched Thermosensitive Hydrogels from Soft Tissue
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Author:
Date:
2017-02-05
[Abstract] Hydrogels are an ideal medium for the expansion of cells in three dimensions. The ability to induce cell expansion and differentiation in a controlled manner is a key goal in tissue engineering. Here we describe a detailed method for producing hydrogels from soft tissues with an emphasis on adipose tissue. In this method, soluble, extractable proteins are recovered from the tissue and stored while the remaining insoluble tissue is processed and solubilised. Once the tissue has been sufficiently solubilised, the extracted proteins are added. The resulting product is a thermosensitive hydrogel with proteins representative of the native tissue. This method addresses common issues encountered when working with some biomaterials, such as high lipid content, DNA contamination, and finding an ...
[摘要] 水凝胶是三维细胞扩增的理想媒介。以受控方式诱导细胞扩增和分化的能力是组织工程中的关键目标。在这里，我们描述了从软组织生产水凝胶的详细方法，重点是脂肪组织。在该方法中，可溶性可提取蛋白从组织中回收并储存，而剩余的不溶组织被加工和溶解。一旦组织被充分溶解，就加入提取的蛋白质。所得产物是具有代表天然组织的蛋白质的热敏水凝胶。这种方法解决了在使用某些生物材料时遇到的常见问题，例如高脂质含量，DNA污染和找到适当的灭菌方法。尽管本文的重点是脂肪组织，但使用这种方法，我们已经从其他软组织（包括肌肉，肝脏和心脏组织）中产生了水凝胶。
背景 组织工程的主要目标是通过向身体提供具有与目标部位相似性质的支架来产生新的组织。这允许最佳的重塑并且使得能够形成新生内源性组织。在脂肪组织工程领域，来自脂肪组织的生物材料是特别有意义的，因为脂肪组织广泛可用，并且在理论上为脂肪形成诱导提供了最佳可能的环境（Flynn等人，2007; Flynn，2010; Uriel等人，2008; Choi等人，2009; Young等人，2011）。已经确定脂肪细胞分泌脂肪形成因子（Li et al。，1998; Shillabeer等人，1989; Shillabeer等人， ...
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| Virus Binding and Internalization Assay for Adeno-associated Virus
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Author:
Date:
2017-01-20
[Abstract] The binding and internalization of adeno-associated virus (AAV) is an important determinant of viral infectivity and tropism. The ability to dissect these two tightly connected cellular processes would allow better understanding and provide insight on virus entry and trafficking. In the following protocol, we describe a quantitative PCR (qPCR) based method to determine the amount of vector bound to the cell surface and the amount of subsequent virus internalization based on viral genome quantification. This protocol is optimized for studying AAV. Nevertheless, it can serve as a backbone for studying other viruses with careful modification.
[摘要] 腺相关病毒（AAV）的结合和内化是病毒感染和向性的重要决定因素。 解决这两个紧密相连的细胞过程的能力将有助于更好地了解并提供有关病毒进入和贩运的洞察。 在以下协议中，我们描述了基于定量PCR（qPCR）的方法，以确定基于病毒基因组定量结合到细胞表面的载体的量和随后的病毒内化的量。 该协议针对研究AAV进行了优化。 然而，它可以作为研究其他病毒，仔细修改的骨干。
【背景】评估AAV生物学的研究通常使用转基因表达作为实验终点。 然而，AAV在到达细胞核并转导细胞之前必须成功导航的许多关键步骤。 因此，AAV感染途径中有多个不同的步骤可能会单独或共同破坏，导致改变的转导。 AAV结合和内化的评估是确定小分子细胞修饰，基于CRISPR的基因敲除，基于siRNA的基因敲除或其他实验程序后观察到的转导差异的原因的重要的第一步
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| Measurement of Mitochondrial DNA Release in Response to ER Stress
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Author:
Date:
2016-06-20
[Abstract] Mitochondria house the metabolic machinery for cellular ATP production. The mitochondrial network is sensitive to perturbations (e.g., oxidative stress and pathogen invasion) that can alter membrane potential, thereby compromising function. Healthy mitochondria maintain high membrane potential due to oxidative phosphorylation (Ly et al., 2003). Changes in mitochondrial function or calcium levels can cause depolarization, or a sharp decrease in mitochondrial membrane potential (Bernardi, 2013). Mitochondrial depolarization induces opening of the mitochondrial permeability transition pore (MPTP), which allows release of mitochondrial components like reactive oxygen species (mtROS), mitochondrial DNA (mtDNA) or intermembrane space proteins into the cytosol ...
[摘要] 线粒体代表细胞ATP生产的代谢机制。线粒体网络对可以改变膜电位，从而损害功能的扰动（氧化应激和病原体侵入）敏感。健康的线粒体由于氧化磷酸化维持高的膜电位（Ly等人，2003）。线粒体功能或钙水平的变化可导致去极化，或线粒体膜电位的急剧下降（Bernardi，2013）。线粒体去极化诱导线粒体通透性转换孔（MPTP）的开放，其允许线粒体组分如活性氧（mtROS），线粒体DNA（mtDNA）或膜间隙蛋白释放到细胞质中（Martinou和Green，2001; Tait和Green ，2010; Bronner和O'Riordan，2014）。这些内容触发炎症，并且可导致细胞死亡（West等人，2011）。 mtROS和细胞溶质mtDNA有助于炎症细胞的活化，多蛋白复合物，其处理促炎细胞因子，IL-18和IL-1β。研究表明，胞质mtDNA尤其可以结合两种不同的炎症小体传感器AIM2和NLRP3，导致炎症小体激活（Burckstummer等人，2009; Hornung和Latz，2010）。在此协议中，您将能够特异性提取细胞质mtDNA并使用qPCR测定法定量。
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