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Author:
Date:
2016-12-05
[Abstract] Genome instability can lead to cell death, senescence and cancerous transformation. Specific repair pathways have evolved to prevent accumulation of DNA lesions. Studying these highly dynamic and specific repair pathways requires precise spatial and temporal resolution, which can be achieved through a combination of laser microirradiaiton and live cell microscopy. DNA lesions are introduced at pre-determined sub-nuclear sites and repair can be analyzed in real time in living cells when using fluorescently tagged repair proteins (Mortusewicz et al., 2008). Alternatively, laser microirradiation can be combined with immunofluorescence analysis to study recruitment of endogenous proteins to laser-induced DNA damage tracks that can be visualized by positive controls like, e.g., ...
[摘要] 基因组不稳定性可导致细胞死亡，衰老和癌性转化。特异性修复途径已经进化以防止DNA损伤的累积。研究这些高度动态和特定的修复途径需要精确的空间和时间分辨率，这可以通过激光微激光和活细胞显微镜的组合实现。当使用荧光标记的修复蛋白时，在预定的亚核位点引入DNA损伤并且可以在活细胞中实时分析修复（Mortusewicz等人，2008）。或者，激光微辐照可与免疫荧光分析结合以研究内源蛋白质对激光诱导的DNA损伤轨迹的募集，其可通过阳性对照例如标记DNA断裂位点的γH2AX显现。
关键字：微辐射，活细胞成像，DNA损伤，DNA修复，DNA损伤，DNA损伤反应，免疫荧光，显微镜等
/strong>哺乳动物细胞的基因组完整性不断受到通过外部和内部来源引入的DNA损伤的挑战。最常见的DNA损伤是氧化碱基，双链断裂，单链断裂，链间和链内交联和UV加合物。已经发展了各种DNA损伤信号传导和修复途径以处理这些损伤。为了使DNA修复快速，精确和有效，涉及感测，信号传导和修复特定DNA损伤的许多蛋白质必须在空间和时间上协调。此外，DNA被组织成更高级的染色质结构，因此对于DNA损伤，DNA修复酶是可及的，染色质必须重塑。激光微照射与高级活细胞显微镜相结合允许在活细胞的上下文中研究这些高度动态的过程（Mortusewicz等人，2008）。这里描述的协议使用405 ...
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Author:
Date:
2015-11-20
[Abstract] Telomerase maintains telomeric DNA in eukaryotes during early developments, ~90% of cancer cells and some proliferative stem like cells. Telomeric repeats at the end of chromosomes are associated with the shelterin complex. This complex consists of TRF1, TRF2, Rap1, TIN2, TPP1, POT1 which protect DNA from being recognized as DNA double-stranded breaks. Critically short telomeres or impaired shelterin proteins can cause telomere dysfunction, which eventually induces DNA damage responses at the telomeres. DNA damage responses can be identified by antibodies to 53BP1, gammaH2AX, Rad17, ATM, and Mre11. DNA damage foci at uncapped telomeres are referred to as Telomere dysfunction-Induced Foci (TIFs) (de Lange, 2005; Takai et al., 2003).
The TIF assay is based on the ...
[摘要] 端粒酶在早期发育期间在真核生物中维持端粒DNA，〜90％的癌细胞和一些增殖性干细胞。染色体末端的端粒重复与shelterin复合物相关。该复合物由TRF1，TRF2，Rap1，TIN2，TPP1，POT1组成，其保护DNA不被识别为DNA双链断裂。临界短的端粒或受损的遮蔽蛋白可引起端粒功能障碍，其最终在端粒诱导DNA损伤反应。 DNA损伤反应可以通过抗53BP1，gammaH2AX，Rad17，ATM和Mre11的抗体来鉴定。未封端的端粒的DNA损伤灶被称为端粒功能障碍诱导的Foci（TIF）（de Lange，2005; Takai等人，2003）。
TIF测定基于使用针对遮蔽蛋白如TRF2之一的抗体对抗DNA损伤标记物例如γ-H2AX和端粒的抗体的DNA损伤的共定位检测（Takai等人，2003; de Lange，2002; Karlseder等人，1999）。我们在这里描述的方法可以用于正常的人类和癌细胞。
其他常用的方法 - Telomere限制性片段（TRF）分析（Mender和Shay，2015b）和端粒重复扩增方案（TRAP） ...
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