| Mouse Adipose Tissue Protein Extraction
|
|
Author:
Date:
2020-06-05
[Abstract] As obesity becomes a global epidemic, the metabolism research field is increasingly focusing on studying the physiological and pathological roles of adipose tissues (AT). However, extracting proteins from AT is challenging due to abundant fat content of intracellular lipid droplets. Several commercial kits for extraction of AT proteins are available, as are protocols (such as the RELi protocol as well as other protein precipitation protocols). The protocols have been introduced to improve the quality and yield of extractions, but these methods either increase the cost or involve multiple steps. Herein, we describe a detailed protocol for mouse AT protein extractions based on our daily laboratory practice. This protocol requires only very common reagents and instruments, and can be ...
[摘要] [摘要 ] 随着肥胖成为全球性流行病，新陈代谢研究领域越来越集中于研究脂肪组织（AT）的生理和病理作用。然而，由于细胞内脂质滴中脂肪含量丰富，从AT中提取蛋白质具有挑战性。可提供用于提取AT蛋白的商业试剂盒，以及方案（例如RELi 该协议已被引入以提高提取的质量和产量，但是这些方法要么增加了成本，要么涉及多个步骤。在此，我们描述了一种基于小鼠AT蛋白提取的详细协议我们的日常实验室操作。该方案仅需非常通用的试剂和仪器即可完成，可在90-120分钟内完成并提供良好的总蛋白质含量回收率。因此，该方案是一种经济诱人，省时且高效的提取方法。来自AT的蛋白质。
[背景 ] 研究脂肪组织（AT）以解决与肥胖症病理生理学相关的问题通常涉及分析AT蛋白质。然而，AT蛋白质样品中的脂质污染严重影响蛋白质定量的准确性，蛋白质印迹图像的质量以及样品处理下游应用对。为了最大限度地减少脂质污染，商业试剂盒已被开发，如分TM 总蛋白提取试剂盒对脂肪组织/脂肪细胞培养S（发明生物技术公司，2017年）。中号矿全面协议的目标是减少脂肪含量，如过量的脂质（的去除RELI ）协议（迪亚兹马林等人，2019）和三氯乙酸（TCA）为基础的蛋白质沉淀法（Benbdelkamel 等人，2018）。尽管提高提取质量已经证实利用在上述过程中，这些方法的缺点也很明显：利用可商购的试剂盒 ...
|
|
|
| RNA Cap Methyltransferase Activity Assay
|
|
Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] Methyltransferases that methylate the guanine-N7 position of the mRNA 5’ cap structure are ubiquitous among eukaryotes and commonly encoded by viruses. Here we provide a detailed protocol for the biochemical analysis of RNA cap methyltransferase activity of biological samples. This assay involves incubation of cap-methyltransferase-containing samples with a [32P]G-capped RNA substrate and S-adenosylmethionine (SAM) to produce RNAs with N7-methylated caps. The extent of cap methylation is then determined by P1 nuclease digestion, thin-layer chromatography (TLC), and phosphorimaging. The protocol described here includes additional steps for generating the [32P]G-capped RNA substrate and for preparing nuclear and cytoplasmic extracts from mammalian cells. This assay is ...
[摘要] 甲基化mRNA 5'帽结构的鸟嘌呤-N7位置的甲基转移酶在真核生物中普遍存在并且通常由病毒编码。这里我们提供生物样品的RNA帽甲基转移酶活性的生化分析的详细方案。该测定包括将含有帽 - 甲基转移酶的样品与[32 P] G-加帽的RNA底物和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）温育以产生具有N7-甲基化帽的RNA。然后通过P1核酸酶消化，薄层色谱（TLC）和磷成像确定帽甲基化的程度。此处描述的方案包括用于产生[32 P] G-加帽的RNA底物和用于从哺乳动物细胞制备核和细胞质提取物的附加步骤。该分析也适用于分析其他生物样品（包括重组蛋白制剂和来自分析分离和免疫沉淀/下拉实验的级分）的帽甲基转移酶活性。
【背景】mRNA的5'端的N7-甲基鸟苷帽是适当的真核mRNA加工，定位和翻译所必需的修饰。 ...
|
|
|
| Tandem Purification of His6-3x FLAG Tagged Proteins for Mass Spectrometry from Arabidopsis
|
|
Author:
Date:
2016-12-05
[Abstract] Tandem affinity purification is a powerful method to identify protein complexes that function in association with a known gene of interest. This protocol describes a methodology to capture proteins tagged with His6-3x FLAG explicitly for the purpose of on-bead digestion and identification by mass spectrometry. The high sensitivity and specificity of our methods allow for purification of proteins expressed at native levels from endogenous promoters to enable uncovering the functional roles of plant protein complexes.
[摘要] 串联亲和纯化是识别与已知感兴趣基因相关联的蛋白质复合物的有力方法。 该方案描述了一种用于捕获用His6-3x FLAG标记的蛋白质的方法，用于通过质谱法进行珠粒消化和鉴定。 我们的方法的高灵敏度和特异性允许从内源启动子纯化以天然水平表达的蛋白质，以揭示植物蛋白复合物的功能作用。
【背景】蛋白质复合物作为信号平台，分子机器和构建细胞生命的支架。鉴定蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）或蛋白质复合物的组成对于提供对基因生物化学功能的了解是非常重要的。因此，需要了解发现PPI的简便方法，以了解基因型如何决定植物中的表型。
通常使用的蛋白质纯化方法包括色谱法，例如大小排阻色谱法（也称为凝胶过滤），离子交换层析和亲和层析。通常需要组合几种不同的色谱方法以达到足够的纯度以鉴定相关的复合物。最近，亲和纯化与质谱联用（AP-MS）已经成为系统地鉴定体内蛋白质 - ...
|
|
|