| Purification and Identification of Novel Host-derived Factors for Influenza Virus Replication from Human Nuclear Extracts
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Author:
Date:
2016-09-20
[Abstract] Recently, we identified two host cell-derived proteins as novel stimulatory factors of influenza virus RNA replication process, termed “Influenza virus REplication Factor-2 (IREF-2)”, from human nuclear extracts (NEs) by employing biochemical complementation assays (Sugiyama et al., 2015). Herein, we describe detailed methods for successive procedures for identification and purification of IREF-2, including large-scale suspension culture of HeLa S3 cells, preparation of NEs and separation of IREF-2 by sequential column chromatography steps. This protocol can be modified and used for purification and identification of the other unknown nuclear protein(s) of your interest.
[摘要] 最近，我们通过使用生物化学互补试验（Sugiyama），从人类核提取物（NE）鉴定了两种宿主细胞衍生蛋白作为流感病毒RNA复制过程的新型刺激因子，称为“流感病毒复制因子-2（IREF-2）” et al。，2015）。 本文描述了用于IREF-2鉴定和纯化的连续方法的详细方法，包括HeLa S3细胞的大规模悬浮培养，NE的制备和顺序柱色谱步骤分离IREF-2。 该方案可以修改并用于纯化和鉴定您感兴趣的其他未知核蛋白。
【背景】甲型流感病毒基因组由8个分段和单链RNA（vRNA）组成。其转录和复制由病毒编码的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）催化。几条证据表明某些宿主衍生因子调节病毒RNA合成（Nagata et al。，2008）。最近，通过相互作用分析和基因组RNAi筛选研究，已经报道了各种宿主衍生的蛋白质作为与病毒RNA合成相关的调节因子候选物。然而，其中包括间接涉及病毒RNA合成的一些假阳性相互作用因子和因子。相反，为了鉴定在病毒RNA合成过程中发挥直接作用的可靠和重要的宿主因子，我们使用了生物化学互补测定系统。在该系统中，在感染的细胞核中有效发生的病毒vRNA复制反应被解剖并在体外使用病毒RNA复制所必需的病毒因子重构，例如衍生自洗涤剂溶解的病毒颗粒的病毒RdRP和模型病毒基因组RNA模板和未感染的核提取物（NE）。
最近，我们已经报道，在体外用病毒因子和NE的粗制部分再现有效的vRNA复制（Sugiyama等，2015）。 ...
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| Purification of a Protein Exhibiting Isoleucine 2-epimerase Activity from Lactobacillus otakiensis JCM 15040
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Author:
Date:
2015-10-20
[Abstract] Prominent accumulation of D-leucine, D-allo-isoleucine and D-valine was observed in the culture medium of the heterofermentative bacterial species, Lactobacillus otakiensis (L. otakiensis) JCM 15040. The racemase enzyme that resulted in this accumulation, isoleucine 2-epimerase, was purified from the bacterial cells. This is the first reported observation of such production of D-branched chain amino acids in lactic acid bacteria, and the first example of a racemase with isoleucine 2-epimerase activity in any organisms. In the described protocol, we introduce methods for purification of this protein from L. otakiensis JCM 15040. Because no specific ligand that has high affinity for this enzyme has been identified, the purification was performed using ...
[摘要] 在异质发酵细菌物种，例如otakiensis的乳酸杆菌（Lactobacillus otakiensis）的培养基中观察到D-亮氨酸，D-异亮氨酸 - 异亮氨酸和D-缬氨酸的显着积累。 otakiensis）JCM 15040.从细菌细胞中纯化导致这种积累的消旋酶，异亮氨酸2-差向异构酶。这是首次报道的在乳酸菌中这种D-支链氨基酸的产生的观察结果，以及在任何生物体中具有异亮氨酸2-差向异构酶活性的消旋酶的第一个实例。在所述的方案中，我们介绍从L中纯化该蛋白质的方法。因为没有鉴定到对该酶具有高亲和力的特异性配体，所以使用硫酸铵级分，四种类型的柱层析和制备型Native-PAGE，不使用亲和柱层析进行纯化。我们希望协议将提供有用的信息用于纯化不能容易地使用亲和柱层析纯化的酶。
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