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Date:
2016-09-20
[Abstract] Recently, we identified two host cell-derived proteins as novel stimulatory factors of influenza virus RNA replication process, termed “Influenza virus REplication Factor-2 (IREF-2)”, from human nuclear extracts (NEs) by employing biochemical complementation assays (Sugiyama et al., 2015). Herein, we describe detailed methods for successive procedures for identification and purification of IREF-2, including large-scale suspension culture of HeLa S3 cells, preparation of NEs and separation of IREF-2 by sequential column chromatography steps. This protocol can be modified and used for purification and identification of the other unknown nuclear protein(s) of your interest.
[摘要] 最近，我们通过使用生物化学互补试验（Sugiyama），从人类核提取物（NE）鉴定了两种宿主细胞衍生蛋白作为流感病毒RNA复制过程的新型刺激因子，称为“流感病毒复制因子-2（IREF-2）” et al。，2015）。 本文描述了用于IREF-2鉴定和纯化的连续方法的详细方法，包括HeLa S3细胞的大规模悬浮培养，NE的制备和顺序柱色谱步骤分离IREF-2。 该方案可以修改并用于纯化和鉴定您感兴趣的其他未知核蛋白。
【背景】甲型流感病毒基因组由8个分段和单链RNA（vRNA）组成。其转录和复制由病毒编码的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）催化。几条证据表明某些宿主衍生因子调节病毒RNA合成（Nagata et al。，2008）。最近，通过相互作用分析和基因组RNAi筛选研究，已经报道了各种宿主衍生的蛋白质作为与病毒RNA合成相关的调节因子候选物。然而，其中包括间接涉及病毒RNA合成的一些假阳性相互作用因子和因子。相反，为了鉴定在病毒RNA合成过程中发挥直接作用的可靠和重要的宿主因子，我们使用了生物化学互补测定系统。在该系统中，在感染的细胞核中有效发生的病毒vRNA复制反应被解剖并在体外使用病毒RNA复制所必需的病毒因子重构，例如衍生自洗涤剂溶解的病毒颗粒的病毒RdRP和模型病毒基因组RNA模板和未感染的核提取物（NE）。
最近，我们已经报道，在体外用病毒因子和NE的粗制部分再现有效的vRNA复制（Sugiyama等，2015）。 ...
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