| Assessment of Modulation of Protein Stability Using Pulse-chase Method
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Author:
Date:
2017-08-20
[Abstract] Pulse-chase technique is a method widely used to assess protein or mRNA stability. The principle of pulse-chase relies on labeling proteins or mRNA produced during a short period of time called ‘pulse’ and then following the rate of disappearance of those labeled proteins over a period of time called ‘chase’. This technique thus allows quantitative analysis of modulation of protein or mRNA stability under different treatments or culturing conditions.
[摘要] 脉冲追踪技术是广泛用于评估蛋白质或mRNA稳定性的方法。 脉冲追踪的原理依赖于在短时间内产生的称为“脉冲”的蛋白质或mRNA的标记，然后遵循称为“追逐”的时间段内那些标记蛋白质的消失速率。 因此，该技术允许在不同处理或培养条件下对蛋白质或mRNA稳定性的调节进行定量分析。
【背景】脉冲追踪技术是一种方法，其涉及在称为“脉冲”的短时间内在含有标记氨基酸的培养基中培养细胞。这导致结合标记的氨基酸的新合成的多肽的产生。脉冲步骤之后是“追逐”步骤，其中洗涤标记培养基以终止标记过程，并被具有非标记氨基酸的培养基代替，以允许在任何给定时间定量初始合成的放射性标记的蛋白质在这个追逐阶段。因此，该技术可以及时地从合成到降解的方法定量分析感兴趣的蛋白质的加工。脉冲追踪方法可用于分析蛋白质折叠，共翻译修饰和细胞内运输等各种过程（Jansens和Braakman 2003;Magadán，2014）。然而，脉冲追踪技术最常用于评估不同实验条件下蛋白质的稳定性。
放射性是常用的标签。标签通常用于使用放射性S35甲硫氨酸的蛋白质。放射性标记的蛋白质的消失动力学依赖于这些蛋白质降解的速度，可以用来检验不同实验条件对蛋白质稳定性的影响。为了评估特定目的蛋白质的稳定性，该蛋白质在使用特异性抗体在脉冲期间产生的所有其它免疫标记的蛋白质免疫沉淀。免疫沉淀将分离在脉冲期间产生并且直到免疫沉淀时尚未降解的放射性标记的蛋白质的比例。然后测量放射性以评估标记蛋白质在一段时间内的相对量。 ...
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| Mating Based Split-ubiquitin Assay for Detection of Protein Interactions
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Author:
Date:
2017-05-05
[Abstract] The mating based split-ubiquitin (mbSUS) assay is an alternative method to the classical yeast two-hybrid system with a number of advantages. The mbSUS assay relies on the ubiquitin-degradation pathway as a sensor for protein-protein interactions, and it is suitable for the determination of interactions between full-length proteins that are cytosolic or membrane-bound. Here we describe the mbSUS assay protocol which has been used for detecting the interaction between K+ channel and SNARE proteins (Grefen et al., 2010 and 2015; Zhang et al., 2015 and 2016)
[摘要] 基于交配的分ubiquitin（mbSUS）测定是具有许多优点的经典酵母双杂交系统的替代方法。 mbSUS测定依赖于泛素降解途径作为蛋白质 - 蛋白质相互作用的传感器，并且它适用于测定细胞溶质或膜结合的全长蛋白质之间的相互作用。在这里，我们描述了已经用于检测K + 通道和SNARE蛋白之间的相互作用的mbSUS测定方案（Grefen等人，2010和2015; Zhang 等等，2015和2016）
背景 图1是mbSUS测定的概况。泛素部分被分成两半，N末端半突变（NubG）以避免重组。泛素部分（Cub）的C末端一半与转录报告基因复合物PLV（Protein A-LexA-VP16）连接。两种蛋白质（X和Y）分别与NubG和CubPLV融合产生蛋白质 - 蛋白质相互作用分析系统。转化后，酵母菌株THY.AP5含有NubG-X融合蛋白，而酵母菌株THY.AP4含有Y-CubPLV融合蛋白。在交配后，在二倍体酵母中，如果蛋白质X和Y彼此相互作用，则将重新组装功能性泛素，这导致PLV的切割。释放的转录蛋白复合物PLV可以开启报告基因（ADE2，HIS3），并允许酵母生长在选择性培养基上。
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| Pulse Chase of Suspension Cells
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Author:
Date:
2014-07-05
[Abstract] Pulse-chase method is a powerful technique used to follow the dynamics of proteins over a period of time. The expression level, processing, transport, secretion or half-life of proteins can be tracked by metabolically labeling the cells, such as with radiolabeled amino acids (pulse step). This protocol describes the condition used to study the folding and disulfide bond formation of immunoglobulin in suspension cells. With some minor modifications, this protocol can be adapted to study the degradation rate or the secretion of target proteins.
[摘要] 脉冲追踪法是用于跟踪蛋白质在一段时间内的动力学的有力技术。 蛋白质的表达水平，加工，转运，分泌或半衰期可以通过代谢标记细胞，例如用放射性标记的氨基酸（脉冲步骤）来追踪。 该方案描述了用于研究悬浮细胞中免疫球蛋白的折叠和二硫键形成的条件。 通过一些微小的修改，这个协议可以适应于研究目标蛋白的降解速率或分泌。
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