| Protocol for Notch-ligand Binding Assays Using Dynabeads
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Author:
Date:
2017-10-20
[Abstract] This protocol describes how to measure interaction between Notch receptors and their ligands by cell-based assay using Dynabeads. We have used the protocol to determine binding capacity between Notch1-transfected HEK293T cells and ligand-coated Dynabeads. Expression of Eogt in Notch1-expressing cells promoted binding toward DLL4-coated beads, but not JAG1-coated beads. The Notch-ligand assay using Dynabeads suggested that Eogt facilitates DLL4-Notch1 interaction (Sawaguchi et al., 2017).
[摘要] 该协议描述了如何使用Dynabeads通过基于细胞的测定来测量Notch受体及其配体之间的相互作用。 我们已经使用方案来确定Notch1转染的HEK293T细胞和配体包被的Dynabeads之间的结合能力。 在Notch1表达细胞中表达Eogt 促进了对DLL4包被的珠粒的结合，而不是JAG1包被的珠粒。 使用Dynabeads的Notch-配体测定表明，Eogt 有助于DLL4-Notch1相互作用（Sawaguchi等人，2017）。
【背景】Notch信号通路调节许多类型的细胞事件，如所有后生动物中的增殖，细胞命运测定和细胞分化（Mumm和Kopan，2000）。为了启动Notch信号传导，Notch受体的细胞外结构域与其配体结合，呈现在相对细胞上的Delta样（DLL）配体或Jagged（JAG）配体）。
Notch受体的表皮生长因子（EGF）样结构域对配体结合至关重要，并由包含O-岩藻糖，O-葡萄糖和O-GlcNAc聚糖的特定聚糖修饰（Stanley和Okajima，2010）。这些聚糖中的一些通过调节Notch受体和配体之间的物理相互作用（Moloney等人，2000）用作Notch信号传导途径的调节剂。为了研究O-GlcNAc是否调节Notch-配体相互作用，我们开发了一种基于Dynabeads的Notch-配体结合测定。在该测定中，在HEK293T细胞上表达的Notch受体与用DLL4-Fc或JAG1-Fc包被的Dynabeads蛋白A孵育。与用于其他结合测定法的可溶性配体不同，Notch配体的方向固定在珠上，使得它们表现得像配体表达细胞。因此，检测到的结合表示反式结合而不是顺式结合，当Notch受体及其配体在相同的细胞中表达时发生。该测定表明，通过Eogt ...
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| Efficient Production of Functional Human NKT Cells from Induced Pluripotent Stem Cells − Reprogramming of Human Vα24+iNKT Cells
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Author:
Date:
2017-05-20
[Abstract] Antigen-specific T cell-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs) have been shown to re-differentiate into functional T cells and thus provide a potential source of T cells that could be useful for cancer immunotherapy. Human Vα24+ invariant natural killer T (Vα24+iNKT) cells are subset of T cells that are characterized by the expression of an invariant Vα24-Jα18 paired with Vβ11, that recognize glycolipids, such as α-galactosylceramide (α-GalCer), presented by the MHC class I-like molecule CD1d. Vα24+iNKT cells capable of producing IFN-γ are reported to augment anti-tumor responses, which affects both NK cells and CD8+ cytotoxic T lymphocytes to eliminate MHC- and MHC+ tumor cells, respectively. Here we describe a ...
[摘要] 抗原特异性T细胞来源的诱导多能干细胞（iPSCs）已显示重新分化为功能性T细胞，从而提供可用于癌症免疫治疗的T细胞的潜在来源。不变性自然杀伤T（Vα24 + iNKT）细胞的人Vα24 + 细胞是T细胞的子集，其特征在于与Vβ11配对的不变Vα24-Jα18的表达，其识别糖脂，如α-半乳糖神经酰胺（α-GalCer），由MHC I类分子CD1d呈递。据报道能够产生IFN-γ的Vα24 + i / KT细胞增加抗肿瘤反应，其影响NK细胞和CD8 +细胞毒性T淋巴细胞以消除MHC - 和MHC + 肿瘤细胞。在这里，我们描述了将人Vα24 + iNKT细胞重编程到iPSC中的鲁棒方案，然后将其重新分化为Vα24 + iNKT细胞（iPS-Vα24功能的iNKT）。我们进一步提供了测定iPS-Vα24 + iNKT细胞活性的方案。背景 以前有报道说，针对晚期非小细胞肺癌（NSCLC）和头颈部癌症的Vα24 + iNKT细胞癌免疫治疗的临床试验显示疗效，耐受性良好（Motohashi et al。等人，2009; Yamasaki等人，2011）。然而，已知来自外周血单核细胞（PBMC）的Vα24 ...
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| 3D Gel Invasion Assay of Gastric Cancer Cells with Fibroblasts
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Author:
Date:
2016-05-05
[Abstract] Cancer tissue is composed of cancer cells and a large number of stromal cells including fibroblasts. In order to understand the relationship between fibroblasts and cancer cells during invasion of the stroma, 3D gel invasion assay is useful. Most tumors are associated with a biologically active type of fibroblasts known as cancer-associated fibroblasts (CAFs), which promote the invasion of cancer cells. Here, we describe the method of imaging the invasion by fluorescently labeled CAFs and gastric cancer cells in gels containing extracellular matrix. For two-color fluorescence labeling of living cells, long-chain dialkylcarbocyanines, DiO and DiI were used. This method is also applicable for studying invasion by other stromal cells and cancer cells, and for evaluation of drugs targeting ...
[摘要] 癌组织由癌细胞和大量包括成纤维细胞的基质细胞组成。 为了理解在基质侵入期间成纤维细胞和癌细胞之间的关系，3D凝胶入侵测定是有用的。 大多数肿瘤与称为癌症相关成纤维细胞（CAF）的生物活性类型的成纤维细胞相关，其促进癌细胞的侵入。 在这里，我们描述的成像入侵的荧光标记CAF和胃癌细胞在含有细胞外基质的凝胶中的方法。 对于活细胞的双色荧光标记，使用长链二烷基碳菁，DiO和DiI。 该方法也适用于研究其他基质细胞和癌细胞的侵袭，以及用于评价靶向癌症基质细胞的药物。
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