| Dual-probe RNA FRET-FISH in Yeast
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Author:
Date:
2018-06-05
[Abstract] mRNA Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) is a technique commonly used to profile the distribution of transcripts in cells. When combined with the common single molecule technique Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), FISH can also be used to profile the co-expression of nearby sequences in the transcript to measure processes such as alternate initiation or splicing variation of the transcript. Unlike in a conventional FISH method using multiple probes to target a single transcript, FRET is limited to the use of two probes labeled with matched dyes and requires the use of sensitized emission. Any widefield microscope capable of sensitive single molecule detection of Cy3 and Cy5 should be able to measure FRET in yeast cells. Alternatively, a FRET-FISH method can be ...
[摘要] mRNA荧光原位杂交（FISH）是一种常用于分析细胞中转录物分布的技术。 当与常见的单分子技术荧光共振能量转移（FRET）相结合时，FISH也可用于分析转录本中附近序列的共表达以测量转录本的替代启动或剪接变异等过程。 与使用多个探针靶向单个转录物的常规FISH方法不同，FRET限于使用用匹配染料标记的两个探针，并且需要使用敏化发射。 任何能够灵敏地检测Cy3和Cy5单分子的宽视场显微镜应该能够测量酵母细胞中的FRET。 或者，可以使用FRET-FISH方法明确确定转录本的身份，而不使用其他FISH技术中使用的引导探针组。
【背景】单细胞转录物分布的定量通常通过用多个探针靶向mRNA来实现，以实现可以与非特异性结合的探针区分开的明亮信号（Raj和Tyagi，2010）。但是，在某些情况下，转录本上有特征，例如剪接变体或替代起始位点，这与常规FISH探针组无法区分。这些同种型序列可以具有短的50nt唯一识别序列。使用两种探针，可以使用FRET对定位结合的任一侧，同时定量多达三种mRNA同种型，例如，具有两种探针的同种型（FRET），具有探针1的同种型仅限于探针2的同种型。依赖于单个荧光团或荧光团对需要通过EMCCD进行灵敏检测。而且，可以使用FRET对（Wadsworth等人，2017）来估计没有其他同种型的序列的探针的检测效率。
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| Single-probe RNA FISH in Yeast
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Author:
Date:
2018-06-05
[Abstract] Quantitative profiling of mRNA expression is an important part of understanding the state of a cell. The technique of RNA Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) involves targeting an RNA transcript with a set of 40 complementary fluorescently labeled DNA oligonucleotide probes. However, there are many circumstances such as transcripts shorter than 200 nt, splicing variations, or alternate initiation sites that create transcripts that would be indistinguishable to a set of multiple probes. To this end we adapted the standard FISH protocol to allow the use of a single probe with a single fluorophore to quantify the amount of transcripts inside budding yeast cells. In addition to allowing the quantification of short transcripts or short features of transcripts, this technique ...
[摘要] mRNA表达的定量分析是理解细胞状态的重要部分。 RNA荧光原位杂交（FISH）技术涉及用一组40个互补的荧光标记的DNA寡核苷酸探针靶向RNA转录物。 然而，许多情况下，如转录本短于200 nt，剪接变异，或创建转录本的替代起始位点，这些转录本与一组多重探针无法区分。 为此，我们调整了标准FISH方案，以允许使用具有单个荧光团的单个探针来量化出芽酵母细胞内的转录物的量。 除了允许定量短转录本或转录本的短特征之外，该技术还降低了执行FISH的成本。
【背景】通过单分子荧光原位杂交（smFISH）可以精确定量单细胞转录谱。 该过程通过用多个荧光标记的DNA寡核苷酸探针靶向单个mRNA分子给出了良好的噪声信号（Raj和Tyagi，2010）。 使用该方案，不能检测到长度短于200个核苷酸的mRNA。 然而，在大多数实验中，绝对转录本拷贝数比相对拷贝数少。 为了检测短的转录物或序列，可以使用短的单个DNA寡核苷酸探针。 当使用单个荧光团计数mRNA时，单个探针的检测效率大于50％（Wadsworth等人，2017）。
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| In vitro Histone H3 Cleavage Assay for Yeast and Chicken Liver H3 Protease
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Author:
Date:
2017-01-05
[Abstract] Histone proteins are subjected to a wide array of reversible and irreversible post-translational modifications (PTMs) (Bannister and Kouzarides, 2011; Azad and Tomar, 2014). The PTMs on histones are known to regulate chromatin structure and function. Histones are irreversibly modified by proteolytic clipping of their tail domains. The proteolytic clipping of histone tails is continuously attracting interest of researchers in the field of chromatin biology. We can recapitulate H3-clipping by performing in vitro H3 cleavage assay. Here, we are presenting the detailed protocol to perform in vitro H3 cleavage assay.
[摘要] 组蛋白受到广泛的可逆和不可逆的翻译后修饰（PTM）（Bannister和Kouzarides，2011; Azad和Tomar，2014）。已知组蛋白上的PTM调节染色质结构和功能。组蛋白不可逆地修饰其尾部结构域的蛋白水解剪切。组蛋白尾巴的蛋白水解剪切不断吸引研究人员在染色质生物学领域的兴趣。我们可以通过在体外实施H3切割测定来概括H3-剪切。在这里，我们提供了详细的方案来进行体外实验。
背景 组蛋白H3剪切是染色质修饰和调节最不了解的机制。预期H3剪切将永久性消除可能影响染色质相关事件的核小体的PTM。此外，切割的组蛋白的命运仍在研究之中，并且已经表明，切割的组蛋白可能在染色质的特定区域被再循环，或者它们被靶向降解。有各种各样的报告描述了不同生物中组蛋白H3的体内剪切，而组蛋白H3特异性剪切的体外测定是有限的。我们需要一种有效和稳健的体外实验来鉴定组蛋白特异性蛋白酶。为此，我们提出了一个可用于检查酵母和鸡肝组织蛋白H3蛋白酶的体外组蛋白H3剪切活性的方案。我们已经优化了测定的温度和pH条件。在我们优化的条件下，发现蛋白酶在所有核心组蛋白中特异性切割组蛋白H3。我们在最近的出版物（Chauhan等人，2016年; Chauhan和Tomar，2016年; Azad和Tomar，2016; ...
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