| In vitro Measurement of CMP-Sialic Acid Transporter Activity in Reconstituted Proteoliposomes
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Author:
Date:
2020-03-20
[Abstract] Nucleotide-sugar transporters (NSTs) facilitate eukaryotic cellular glycosylation by transporting nucleotide-sugar conjugates into the Golgi lumen and endoplasmic reticulum for use by glycosyltransferases, while also transferring nucleotide monophosphate byproducts to the cytoplasm. Mutations in this family of proteins can cause a number of significant cellular pathologies, and wild type members can act as virulence factors for many parasites and fungi. Here, we describe an in vitro assay to measure the transport activity of the CMP-sialic acid transporter (CST), one of seven NSTs found in mammals. While in vitro transport assays have been previously described for CST, these studies failed to account for the fact that 1) commercially available stocks of CMP-sialic acid ...
[摘要] [ 摘要] 核苷酸糖转运蛋白（NST）通过将核苷酸糖结合物转运到高尔基腔和内质网供糖基转移酶使用，同时将核苷酸单磷酸副产物转移到细胞质中，从而促进了真核细胞的糖基化。该蛋白质家族的突变可引起许多重要的细胞病理，野生型成员可充当许多寄生虫和真菌的致病因子。在这里，我们描述了一种体外测定法，以测量CMP-唾液酸转运蛋白（CST）的转运活性，CMP-唾液酸转运蛋白（CST）是在哺乳动物中发现的七个NST之一。虽然在体外 以前已经针对CST进行了转运分析，但这些研究未能说明以下事实：1 ）CMP- 唾液酸（CMP-Sia ）的商业库存由约10％的高亲和力CMP组成，以及2）CMP- SIA 是水解d 到CMP和在水溶液中的唾液酸。在这里，我们描述了一种用非选择性磷酸酶南极磷酸酶治疗CMP-Sia的方法，以将所有游离CMP转化为胞苷。这使我们能够准确地测量重组为蛋白脂质体的纯化CST的底物亲和力和运输动力学。
[ 背景技术]一旦在细胞质或细胞核合成，核苷酸偶联的糖被输送到内质网的内腔（ER）由核苷酸-糖转运蛋白（NSTS）或高尔基体（青木等人，2003）。在这些亚细胞区室中，糖基转移酶利用糖部分糖基化脂质和蛋白质，产生副产物核苷酸单磷酸酯（NMP）（Capasso和Hirschberg，1984 ；Milla和Hirschberg ，1989； ...
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| Tandem Purification of His6-3x FLAG Tagged Proteins for Mass Spectrometry from Arabidopsis
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Author:
Date:
2016-12-05
[Abstract] Tandem affinity purification is a powerful method to identify protein complexes that function in association with a known gene of interest. This protocol describes a methodology to capture proteins tagged with His6-3x FLAG explicitly for the purpose of on-bead digestion and identification by mass spectrometry. The high sensitivity and specificity of our methods allow for purification of proteins expressed at native levels from endogenous promoters to enable uncovering the functional roles of plant protein complexes.
[摘要] 串联亲和纯化是识别与已知感兴趣基因相关联的蛋白质复合物的有力方法。 该方案描述了一种用于捕获用His6-3x FLAG标记的蛋白质的方法，用于通过质谱法进行珠粒消化和鉴定。 我们的方法的高灵敏度和特异性允许从内源启动子纯化以天然水平表达的蛋白质，以揭示植物蛋白复合物的功能作用。
【背景】蛋白质复合物作为信号平台，分子机器和构建细胞生命的支架。鉴定蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）或蛋白质复合物的组成对于提供对基因生物化学功能的了解是非常重要的。因此，需要了解发现PPI的简便方法，以了解基因型如何决定植物中的表型。
通常使用的蛋白质纯化方法包括色谱法，例如大小排阻色谱法（也称为凝胶过滤），离子交换层析和亲和层析。通常需要组合几种不同的色谱方法以达到足够的纯度以鉴定相关的复合物。最近，亲和纯化与质谱联用（AP-MS）已经成为系统地鉴定体内蛋白质 - ...
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| High-throughput Quantification of Ammonium Content in Arabidopsis
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Author:
Date:
2015-08-20
[Abstract] This protocol is a simple colorimetric assay for internal ammonium quantification in aqueous extracts from plant tissues. The method is based on the phenol hypochlorite assay (Berthelot reaction):
NH4+ + hypochlorite + OH- + phenol → indophenol
The oxidation of indophenol caused by phenol oxidation is a blue dye that is quantified at 635 nm in a spectrophotometer. Per ammonium molecule one molecule of indophenol is formed. The protocol described here is for Arabidopsis thaliana (A. thaliana) leaves and roots, although it is also valid for other plants species.
[摘要] 该方案是一种简单的比色测定法，用于在植物组织的水性提取物中进行内部铵定量。 该方法基于苯酚次氯酸盐测定（Berthelot反应）：
NH 4+ sup + +次氯酸盐+ OH - +苯酚→靛酚
由酚氧化引起的靛酚的氧化是在分光光度计中在635nm处定量的蓝色染料。 每个铵分子形成一个靛酚分子。 这里描述的方案是用于拟南芥（拟南芥）叶和根，虽然它也适用于其他植物物种。
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