| Detecting the Interaction of Double-stranded RNA Binding Protein, Viral Protein and Primary miRNA Transcript by Co-immunoprecipitation in planta
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Author:
Date:
2018-05-05
[Abstract] MicroRNAs (miRNAs) play important roles in plant growth, development, and response to infection by microbes. Double-stranded RNA binding protein 1 (DRB1) facilitates the processing of primary miRNA transcripts into mature miRNAs. Recently, we found that NS3 protein encoded by rice stripe virus (RSV) associates with DRB1 and promotes miRNA biogenesis during RSV infection (Zheng et al., 2017). RNA co-immunoprecipitation (RIP) method was applied to identity association patterns among DRB1, NS3, and miRNA transcript.
[摘要] 微小RNA（miRNA）在植物生长，发育和微生物感染反应中发挥重要作用。 双链RNA结合蛋白1（DRB1）有助于将初级miRNA转录物加工成成熟的miRNA。 最近，我们发现水稻条纹病毒（RSV）编码的NS3蛋白与DRB1相关并促进RSV感染期间的miRNA生物合成（Zheng等人，2017）。 RNA共免疫沉淀（RIP）方法被用于鉴定DRB1，NS3和miRNA转录物之间的关联模式。
【背景】在双链RNA（dsRNA）结合蛋白HYPONASTIC LEAVES1（DRB1 / HYL1）的帮助下，通过RNA酶III酶DICER-LIKE1（DCL1）从其初级转录物（pri-miRNA） 锌指蛋白SERRATE（SE）。 水稻条纹病毒（RSV）感染广泛地干扰miRNA积累。 我们发现RSV编码的非结构蛋白3（NS3）通过与水稻中的DRB1相互作用下调pri-miRNAs来促进miRNA积累（Zheng等人，2017）。 为了揭示NS3如何增强pri-miRNA的加工，我们使用免疫共沉淀（Co-IP）来说明NS3，DRB1和pri-miRNA体内的关系。 该协议有助于了解两种蛋白质和一种RNA转录本之间的关联模式。
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| In vitro Reconstitution Assay of miRNA Biogenesis by Arabidopsis DCL1
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Author:
Date:
2015-04-20
[Abstract] microRNAs (miRNAs) are small non-coding RNAs, regulating most if not all, biological processes in eukaryotic organisms. miRNAs are initially processed from primary transcripts (pri-miRNAs) to produce miRNA precursors (pre-miRNAs), that are further processed into miRNA and its complementary strands (miRNA/*). In Arabidopsis, and possibly other plants, the processing from pri-miRNAs to pre-miRNAs and from pre-miRNAs to miRNA/* are both implemented through Dicer-like 1 (DCL1) complexes. Recently, we demonstrated isolation of DCL1 complexes of unprecedented quality from in planta. We further successfully reconstituted DCL1 cleavage assays in vitro that were able to fully recapitulate in vivo miRNA biogenesis. Here we provide a detailed protocol of DCL1 ...
[摘要] 微小RNA（miRNA）是小的非编码RNA，其调节真核生物中的大多数（如果不是全部）生物过程。 miRNA最初从初级转录物（pri-miRNA）加工以产生miRNA前体（前-miRNA），其进一步加工成miRNA及其互补链（miRNA/*）。在拟南芥和可能的其他植物中，从pri-miRNA到pre-miRNA和从pre-miRNA到miRNA/*的加工都通过Dicer样1（DCL1）复合物实现。最近，我们证明了从植物中以前的质量的DCL1复合物的分离。我们进一步成功地重建了能够完全重现体内 miRNA生物发生的DCL1切割测定。在这里我们提供DCL1重建测定的详细协议。该方案包括三个主要部分（图1）：1）pri-miRNA和pre-miRNA转录物的制备（方法A-C）; 2）通过免疫沉淀（IP）纯化来自本塞姆氏烟草（本塞姆氏烟草）的重组拟南芥DCL1机器（程序D和E）;和3）使用分离的DCL1复合物（步骤F）在放射性同位素标记的pri-miRNA或pre-miRNA的体外处理。这是我们的愿望，协议是RNAi社区研究机械问题或开发RNA沉默技术的强大工具。
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