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Date:
2015-02-05
[Abstract] Cyclic di-GMP (c-di-GMP) is a ubiquitous second messenger that regulates many processes in bacteria including biofilm formation, motility, and virulence (Hengge, 2009). Analysis of c-di-GMP binding properties of bacterial proteins is an important step to characterize c-di-GMP signaling pathways. C-di-GMP binds numerous proteins such as transcription factors, enzymes, and multimeric protein complexes (Hickman and Harwood, 2008, Ryjenkov et al., 2006, Weinhouse et al., 1997). The c-di-GMP binding assay described here is a relatively simple and cost effective method to characterize c-di-GMP binding to a protein using [32P]-labeled c-di-GMP. Radiolabeled c-di-GMP is readily synthesized with a purified GGDEF enzyme [such as WspR from Pseudomonas aeruginosa ...
[摘要] 循环di-GMP（c-di-GMP）是一种普遍存在的第二信使，其调节细菌中的许多过程，包括生物膜形成，运动性和毒力（Hengge，2009）。细菌蛋白的c-di-GMP结合性质的分析是表征c-di-GMP信号传导途径的重要步骤。 C-di-GMP结合许多蛋白质，例如转录因子，酶和多聚体蛋白复合物（Hickman和Harwood，2008，Ryjenkov等人，2006，Weinhouse等人>，1997）。本文所述的c-di-GMP结合测定法是使用[32 P] - 标记的c-di-GMP表征c-di-GMP与蛋白质结合的相对简单且成本有效的方法。放射性标记的c-di-GMP易于用纯化的GGDEF酶[例如来自绿脓假单胞菌（铜绿假单胞菌）（绿脓杆菌）]的WspR和[<32> > P] -GTP（Srivastava等人，2013）。在标记的c-di-GMP与溶液中目标蛋白温育后，将所得混合物通过硝酸纤维素蛋白结合膜过滤。保留在膜上的标记的c-di-GMP的量指示信号和蛋白质之间的相互作用。可以通过与未标记的c-di-GMP或其他核苷酸（例如反应中的GTP）竞争来测试c-di-GMP结合的特异性。通过检测固定蛋白浓度与增加浓度的c-di-GMP的结合，该方法能够确定c-di-GMP-蛋白相互作用的解离常数。
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