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Author:
Date:
2012-08-05
[Abstract] Tandem affinity purification (TAP) (Pugi et al.,2001; Rigaut et al., 1999) is a method that uses a tagging approach of a target protein of interest for a two-step purification scheme in order to pull down protein complexes under native conditions and expression levels. The TAP tag consists of three components: a calmodulin-binding peptide, a Tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site and Protein A which is an immunoglobulin G (IgG)-binding domain. This protocol was modified from the original methodology used in yeast cells(Pugi et al.,2001; Rigaut et al., 1999) for isolation of protein complexes from Drosophila heads and ovaries expressing a TAP tagged protein of interest. To determine in vivo binding partners of the Drosophila fragile X ...
[摘要] 串联亲和纯化（TAP）（Pugi等人，2001; Rigaut等人，1999）是使用目标靶蛋白的标记方法的方法两步纯化方案以在天然条件和表达水平下下拉蛋白复合物。 TAP标签由三种组分组成：钙调素结合肽，烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶切割位点和作为免疫球蛋白G（IgG）结合结构域的蛋白A.该方案从酵母细胞中使用的原始方法（Pugi等人，2001; Rigaut等人，1999）修饰，用于从果蝇头分离蛋白质复合物，以及卵巢表达感兴趣的TAP标记的蛋白质。为了确定果蝇脆弱X蛋白（dFMR1）的体内结合伴侣，我们开发了表达重组形式的具有羧基末端TAP标签的dFMR1的苍蝇的转基因菌株（Tsai和Carstens，2006）。为了确保构建体在野生型水平表达，我们在救援突变不育表型的基因组拯救构建体的上下文中工程化这种形式的标记蛋白质。使用温和条件进行纯化过程以维持天然蛋白质相互作用。对于在果蝇S2细胞培养物中的TAP方法，我们成功地使用了由Tsai和Carstens先前公布的方案（Tsai和Carstens，2006; Bhogal等人，2011）。
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