| CENP-C Phosphorylation by CDK1 in vitro
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Author:
Date:
2021-01-05
[Abstract] Accurate chromosome segregation during mitosis requires the kinetochore, a large protein complex, which makes a linkage between chromosomes and spindle microtubes. An essential kinetochore component, CENP-C, is phosphorylated by Cyclin-B-Cyclin dependent kinase 1 (CDK1) that is a master kinase for mitotic progression, promoting proper kinetochore assembly during mitosis. Here, we describe an in vitro CDK1 kinase assay to detect CENP-C phosphorylation using Phos-tag SDS-PAGE without radiolabeled ATP. Our protocol has advantages in ease and safety over conventional phosphorylation assays using [γ-32P]-ATP, which has potential hazards despite their better sensitivity. The protocol described here can be applicable to other kinases and be also useful for analysis of phospho-sites in ...
[摘要] [摘要]在有丝分裂过程中，准确的染色体分离需要动线粒体（一种大型蛋白复合物），使染色体与纺锤体微管之间形成联系。必需的线粒体成分CENP-C被细胞周期蛋白B-细胞周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）磷酸化，该激酶是有丝分裂进程的主要激酶，在有丝分裂过程中促进适当的线粒体组装。在这里，我们描述了一种体外CDK1激酶测定法，可使用Phos -tag SDS-PAGE检测CENP-C磷酸化而无放射性ATP 。ø乌尔协议具有使用[γ-在容易且安全优于常规磷酸化试验的优点32 P] -ATP ，其具有潜在危险，尽管其敏感性更高。该协议describ编这里可以适用于其他激酶并且也用于在基板磷酸位点的分析是有用的体外。
[背景]细胞周期蛋白-B细胞周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）是有丝分裂的主要调节剂，其磷酸化许多靶标以确保有丝分裂的进展（Nurse，1990 ; Malumbres and Barbacid ，2005 ）。在有丝分裂期间，携带遗传信息的染色体被平均分为两个子细胞。线粒体是关键的大蛋白复合物，通过在染色体和纺锤体微管之间架桥来确保忠实的染色体分离（Fukagawa和Earnshaw，2014）。组成动线粒的各种蛋白质被CDK1磷酸化（Gascoigne等人，2013; Nishino等人，2013; Hara等人，2018b; ...
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| In vitro RNA-dependent RNA Polymerase Assay Using Arabidopsis RDR6
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Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] RNA-dependent RNA polymerases (RdRPs) in eukaryotes convert single-stranded RNAs into double-stranded RNAs, thereby amplifying small interfering RNAs that play crucial roles in the regulation of development, maintenance of genome integrity and antiviral immunity. Here, we describe a method of in vitro RdRP assay using recombinant Arabidopsis RDR6 prepared by an insect expression system. By using this classical biochemical assay, we revealed that RDR6 has a strong template preference for RNAs lacking a poly(A) tail. This simple method will be applicable to other RdRPs in Arabidopsis and different organisms.
[摘要] 真核生物中的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）将单链RNA转化为双链RNA，从而扩增在调节发育，维持基因组完整性和抗病毒免疫方面起关键作用的小干扰RNA。 在此，我们描述了使用通过昆虫表达系统制备的重组拟南芥RDR6的体外RdRP测定的方法。 通过使用这种经典的生物化学分析，我们发现RDR6有一个强大的模板偏好RNAs缺乏poly（A）尾巴。 这个简单的方法将适用于拟南芥属和其他生物体中的其他RdRPs。
【背景】已经在所有真核生物王国 - 植物，真菌，原生动物和动物中发现RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）基因（Zong等人，2009）。它们将单链RNA（ssRNA）转化为双链RNA（dsRNA），从而扩增在各种生物过程中发挥关键作用的小干扰RNA（siRNA），包括调节发育（Peragine等人， ，2004; Li等人，2005），维持基因组完整性（Volpe等人，2002; Xie等人，2004年， ）和抗病毒免疫性（Mourrain等人，2000; Yu等人，2003; Garcia-Ruiz等人，2010; Wang ，2010）。除了这种RdRP活性之外，RdRP还具有称为末端核苷酸转移酶（TNTase）活性的另一种酶活性（Curaba和Chen，2008; ...
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| Root-knot Nematode Penetration and Sclareol Nematicidal Activity Assays
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Author:
Date:
2016-06-20
[Abstract] Plant parasitic nematodes parasitize roots and/or stems of various plants thereby inhibiting absorption of nutrients and moisture. In particular, root-knot nematodes (RKN) are a group of the most devastating pests. Various techniques, such as soil sterilization, cultivation of resistant crops, and chemical application, have been developed to control damage caused by RKN. Among these techniques, diminish by chemicals that induce or activate host defense to RKN is an attractive method because of its potential to reduce the environmental burden caused by crop protection. Sclareol, a diterpene, was identified as a chemical that induces resistance to RKN (Fujimoto et al., 2015). Here we provide a protocol for assessing the impact of sclareol on the penetration of RKNs into tomato and Arabidopsis ...
[摘要] 植物寄生线虫寄生于各种植物的根和/或茎，从而抑制营养物和水分的吸收。 特别地，根结线虫（RKN）是最具破坏性的害虫的组。 已经开发了各种技术，例如土壤灭菌，抗性作物的栽培和化学施用，以控制由RKN引起的损害。 在这些技术中，诱导或激活RKN的宿主防御的化学物质的减少是有吸引力的方法，因为其具有减少作物保护所引起的环境负担的潜力。 Sclareol，一种二萜，被鉴定为诱导对RKN的抗性的化学物质（Fujimoto等人，2015）。 在这里我们提供了评估香紫苏醇对RKNs对番茄和拟南芥根的渗透以及化学物对线虫的直接杀线虫影响的影响的方案。 该方案可用于其它线虫抗性诱导化学品。
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