| Structural Analysis of Target Protein by Substituted Cysteine Accessibility Method
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Author:
Date:
2018-09-05
[Abstract] Substituted Cysteine Accessibility Method (SCAM) is a biochemical approach to investigate the water accessibility or the spatial distance of particular cysteine residues substituted in the target protein. Protein topology and structure can be annotated by labeling with methanethiosulfonate reagents that specifically react with the cysteine residues facing the hydrophilic environment, even within the transmembrane domain. Cysteine crosslinking experiments provide us with information about the distance between two cysteine residues. The combination of these methods enables us to obtain information about the structural changes of the target protein. Here, we describe the detailed protocol for structural analysis using SCAM.
[摘要] 取代半胱氨酸可及性方法（SCAM）是一种生物化学方法，用于研究目标蛋白中取代的特定半胱氨酸残基的水可及性或空间距离。蛋白质拓扑和结构可以通过用甲硫代磺酸盐试剂标记来注释，所述甲硫基磺酸盐试剂特异性地与面向亲水环境的半胱氨酸残基反应，甚至在跨膜结构域内。半胱氨酸交联实验为我们提供了关于两个半胱氨酸残基之间距离的信息。这些方法的组合使我们能够获得有关靶蛋白结构变化的信息。在这里，我们描述了使用SCAM进行结构分析的详细协议。
【背景】结构分析提供了关于靶蛋白功能的关键信息。 X射线晶体学和核磁共振已被用作生物学领域中的高分辨率蛋白质结构分析方法。然而，这些方法需要以非常高的浓度从膜中提取的纯化蛋白质用于膜蛋白的结构分析。取代半胱氨酸可及性方法（SCAM）是一种生化方法，用于分析目标蛋白中取代的特定半胱氨酸残基的水可及性和空间距离。使用特异性地与面向亲水环境的半胱氨酸残基反应的甲硫代磺酸盐（MTS）试剂，我们可以注释目标蛋白的拓扑结构和结构。由于标记试剂 N - 生物素氨基乙基甲硫基磺酸盐（MTSEA-生物素）对质膜是不可渗透的（Seal et ...
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| Liposome Flotation Assay for Studying Interactions Between Rubella Virus Particles and Lipid Membranes
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Author:
Date:
2018-08-20
[Abstract] Rubella virus (RuV) is an enveloped, positive-sense single-stranded RNA virus that is pathogenic to humans. RuV binds to the target cell via the viral envelope protein E1, but the specific receptor molecules on the target cell are yet to be fully elucidated. Here, we describe a protocol for liposome flotation assay to study direct interactions between RuV particles and lipid membranes in a qualitative manner. Interactions are examined by a Nycodenz density gradient fractionation using UV-inactivated RuV particles and fluorescent-labeled liposomes consisting of pure lipids. Fractionated RuV particles are detected using standard sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by Western blot analysis for viral proteins. On the Nycodenz gradient, RuV particles ...
[摘要] 风疹病毒（RuV）是一种包膜的正义单链RNA病毒，对人类具有致病性。 RuV通过病毒包膜蛋白E1与靶细胞结合，但靶细胞上的特异性受体分子尚未完全阐明。在这里，我们描述了脂质体浮选测定的方案，以定性方式研究RuV颗粒和脂质膜之间的直接相互作用。使用UV-灭活的RuV颗粒和由纯脂质组成的荧光标记的脂质体通过Nycodenz密度梯度分级检查相互作用。使用标准十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测分级的RuV颗粒，然后对病毒蛋白进行Western印迹分析。在Nycodenz梯度上，与未结合的RuV颗粒相比，与脂质体结合的RuV颗粒转移至较低密度的部分。使用该方案，我们提供了令人信服的证据，即在中性pH下以钙依赖性方式，RuV颗粒与某些细胞类型中含有鞘磷脂（SM）和胆固醇的脂质膜结合。
【背景】 风疹病毒是“风疹”的致病因子，“风疹”是一种急性且相对轻微的全身性感染和“先天性风疹综合征”，一种导致严重出生缺陷的转胎胎儿感染（Hobman，2013）。阐明RuV进入的分子机制对于了解病毒病理学和帮助开发抗RuV药物是必不可少的。虽然以前的研究表明宿主细胞的膜脂质作为RuV受体（Mastromarino et al。，1989和1990; DuBois et ...
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| Microscopic Observation of Subcellular GFP-tagged Protein Localization in Rice Anthers
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Author:
Date:
2018-08-05
[Abstract] This protocol demonstrates a simple method to determine the subcellular localization of fluorescence-tagged proteins on the vibratome sections of rice developing anthers. If a cell type-specific promoter is used to drive the tagged protein-encoding gene, the method enables to clearly distinguish the cells retaining fluorescent signals from other anther cells. It is applicable to both live and fixed samples, and presumably to other plant tissues.
[摘要] 该方案演示了一种确定荧光标记蛋白在水稻发育花药的振动切片上的亚细胞定位的简单方法。 如果使用细胞类型特异性启动子来驱动标记的蛋白质编码基因，该方法能够清楚地区分保留荧光信号的细胞与其他花药细胞。 它适用于活的和固定的样品，并且可能适用于其他植物组织。
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