| Isolation, Culture, and Differentiation of Primary Myoblasts Derived from Muscle Satellite Cells
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Author:
Date:
2020-07-20
[Abstract] The skeletal muscle is key for body mobility and motor performance, but aging and diseases often lead to progressive loss of muscle mass due to wasting or degeneration of muscle cells. Muscle satellite cells (MuSCs) represent a population of tissue stem cells residing in the skeletal muscles and are responsible for homeostatic maintenance and regeneration of skeletal muscles. Growth, injury, and degenerative signals activate MuSCs, which then proliferate (proliferating MuSCs are called myoblasts), differentiate and fuse with existing multinuclear muscle cells (myofibers) to mediate muscle growth and repair. Here, we describe a protocol for isolating MuSCs from skeletal muscles of mice for in vitro analysis. In addition, we provide a detailed protocol on how to culture and ...
[摘要] [摘要] 骨骼肌是身体活动和运动表现的关键，但是衰老和疾病通常会由于肌肉细胞的浪费或变性而导致肌肉质量的逐步丧失。肌卫星细胞（MuSCs）代表的组织STE群体米细胞小号居住在骨骼肌和负责骨骼肌的体内平衡维持和再生。生长，损伤和变性信号激活MuSC，然后增殖（增殖的MuSC被称为成肌细胞），分化并与现有的多核肌肉细胞（肌纤维）融合，以介导肌肉的生长和修复。在这里，我们描述了从小鼠骨骼肌中分离MuSC的体外实验方案分析。此外，我们提供了有关如何将原代成肌细胞培养和分化成肌管的详细协议，以及用于表征细胞的免疫荧光染色程序。这些方法对于在体外模拟再生肌生成以了解MuSC 的动力学，功能和分子调控至关重要。
[背景] 通过多种细胞功能维持肌肉的动态平衡，对于保持肌肉的完整性至关重要。组织特异性成体干细胞能够在整个生命中连续不断地再生局部组织。在成年骨骼肌中，称为肌肉卫星细胞（MuSC）的干细胞群具有强大的再生能力，这是肌肉动态平衡的关键（Yin 等人，2013； Dumont 等人，2016）。静态MuSC位于与肌肉纤维并列的基底层下方的壁iche中，负责肌肉的生长和再生（Yin 等人，2013； Dumont 等人，2016）。
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| Electrophoretic Mobility Shift Assay of in vitro Phosphorylated RNA Polymerase II Carboxyl-terminal Domain Substrates
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Author:
Date:
2020-06-20
[Abstract] Eukaryotic RNA polymerase II transcribes all protein-coding mRNAs and is highly regulated. A key mechanism directing RNA polymerase II and facilitating the co-transcriptional processing of mRNAs is the phosphorylation of its highly repetitive carboxyl-terminal domain (CTD) of its largest subunit, RPB1, at specific residues. A variety of techniques exist to identify and quantify the degree of CTD phosphorylation, including phosphorylation-specific antibodies and mass spectrometry. Electrophoretic mobility shift assays (EMSAs) have been utilized since the discovery of CTD phosphorylation and continue to represent a simple, direct, and widely applicable approach for qualitatively monitoring CTD phosphorylation. We present a standardized method for EMSA analysis of recombinant GST-CTD ...
[摘要] [摘要 ] 真核RNA聚合酶II转录所有编码蛋白质的mRNA，并且受到高度调节。指导RNA聚合酶II并促进mRNA的共转录加工的关键机制是其高度重复的羧基末端结构域（CTD）的磷酸化。最大的亚基RPB1位于特定残基。存在多种鉴定和定量CTD磷酸化程度的技术，包括磷酸化特异性抗体和质谱法。自发现CTD磷酸化和本文提出了一种标准化的方法，用于EMSA分析被多种CTD激酶磷酸化的重组GST-CTD底物的EMSA方法，以及在变性/还原和还原条件下分析样品的策略。提供了半本地条件。此方法表示简单，直接，以及使用分子生物学实验室通用的设备监测重组底物中CTD磷酸化的可重现方法，该设备可轻松应用于下游分析，包括免疫印迹和质谱分析。
[背景 ] 真核生物RNA聚合酶II（RNAPII）产生所有蛋白质编码的mRNA，小核，小核仁，和许多微小RNA （杰罗尼莫等，2013;梅菲尔德。等，2016） 。各种机制中规范RNAPII活动要赋予特异性基因表达和促进生物处理工艺。在这些是直接翻译后修饰中RNAPII自己在形式的磷酸化（梅菲尔德等，2016） ，脯氨酰异构（梅菲尔德等，2015） ，甲基化（迪亚斯等人，2015年）和乙酰化（交银施罗德等，2013） 。一些研究最多的修饰是磷酸化的C端结构域RNAPII最大的亚基RPB1中（CTD） ...
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| Optic Nerve Crush in Mice to Study Retinal Ganglion Cell Survival and Regeneration
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Author:
Date:
2020-03-20
[Abstract] In diseases such as glaucoma, the failure of retinal ganglion cell (RGC) neurons to survive or regenerate their optic nerve axons underlies partial and, in some cases, complete vision loss. Optic nerve crush (ONC) serves as a useful model not only of traumatic optic neuropathy but also of glaucomatous injury, as it similarly induces RGC cell death and degeneration. Intravitreal injection of adeno-associated virus serotype 2 (AAV2) has been shown to specifically and efficiently transduce RGCs in vivo and has thus been proposed as an effective means of gene delivery for the treatment of glaucoma. Indeed, we and others routinely use AAV2 to study the mechanisms that promote neuroprotection and axon regeneration in RGCs following ONC. Herein, we describe a step-by-step protocol to ...
[摘要] [摘要 ] 在青光眼等疾病中，视网膜神经节细胞（RGC）神经元无法存活或无法再生视神经轴突，这是部分视力丧失的原因，在某些情况下，甚至是完全的视力丧失。视神经挤压术（ONC）不仅可以作为创伤性视神经病变的一种有用模型，而且还可以作为青光眼损伤的有用模型，因为它类似地诱导RGC细胞死亡和变性。腺相关病毒血清型2（AAV2）的玻璃体内注射已被证明特别地和有效地转导视网膜神经节细胞在体内和已因而被提出作为基因递送用于治疗青光眼的治疗的有效手段。确实，我们和其他人常规使用AAV2来研究促进ONC 后RGC中神经保护和轴突再生的机制。本文中，我们描述了分步操作的方案，以测定AAV2介导的转导和ONC损伤后小鼠中RGC的存活和再生，包括1）玻璃体内注射AAV2病毒载体，2）视神经挤压，3）霍乱毒素B （CTB）标记再生轴突，4）视神经清除，5）视网膜平面免疫染色和6）定量RGC存活和再生。除了提供执行此协议所需的所有材料和程序详细信息之外，我们还强调了它比其他相似的已发表方法的优势，并提供了有用的技巧以确保其在任何现代实验室中都能如实复制。
[背景 ] 青光眼是世界范围内不可逆失明的主要原因，其特征是视网膜神经节细胞（RGCs）逐渐退化和丧失，这是构成连接视网膜与大脑的视神经的中央投射神经元（Quigley ，2011 ; Tham ...
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