| In vitro Autophosphorylation and Phosphotransfer Assay of Cyanobacterial Histidine Kinase 2
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Author:
Date:
2016-12-05
[Abstract] This is a detailed protocol of an autophosphorylation and phosphotransfer activities of Synechocystis sp. PCC 6803 full-length Histidine Kinase 2 (Hik2) protein described by Ibrahim et al., 2016. In this protocol, radioactively labelled ATP was used to study an autophosphorylation and phosphotransfer activity of the full-length Hik2 protein.
[摘要] 这是集胞藻的自磷酸化和磷酸转移活性的详细方案。在该方案中，使用放射性标记的ATP来研究全长Hik2的自磷酸化和磷酸转移活性，所述磷酸转移活性是由Ibrahim等人在2016年描述的。蛋白。
关键字：组氨酸激酶2，自身磷酸化，磷酸转移，Rre1，RppA，集胞藻。 PCC 6803
[背景] 蛋白磷酸化是发生在每个活生物体中的蛋白质的重要翻译后修饰。蛋白激酶（催化蛋白质磷酸化的酶）的活性首先由Burnett和Kennedy在1954年描述，其中它们通过肝酶显示酪蛋白的磷酸化（Burnett和Kennedy，1954）。然而，它的意义直到20世纪70年代和80年代才被欣赏（Cohen，2002）。可以使用偶联测定或直接用放射性标记的ATP研究磷酸γ-磷酸从ATP分子转移到蛋白质。基于掺入32 ...
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| Assay of the Carboxylase Activity of Rubisco from Chlamydomonas reinhardtii
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Author:
Date:
2015-12-05
[Abstract] The performance of the carbon-fixing enzyme, ribulose 1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (EC 4.1.1.39, Rubisco), controls biomass accumulation in green plants, algae and most autotrophic bacteria. In particular, the carboxylase activity of Rubisco incorporates carbon from CO2 to ribulose 1, 5-bisphosphate (RuBP) producing two molecules of 3-phosphoglycerate. Here a detailed protocol is given for the assay of the carboxylase activity of Rubisco from Chlamydomonas reinhardtii, a model organism for chloroplast studies and a fitting host for biotechnologically oriented genetic manipulation of the enzyme. Rubisco has to be pre-incubated with Mg2+ ions and bicarbonate to induce the catalytically competent active center (Laing and Christeller, 1976). Once ...
[摘要] 碳固定酶，核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（EC 4.1.1.39，Rubisco）的性能控制绿色植物，藻类和大多数自养细菌中的生物量积累。特别地，Rubisco的羧化酶活性掺入来自CO 2的碳到产生两分子3-磷酸甘油酸的核酮糖1,5-二磷酸（RuBP）。这里给出了用于来自莱茵衣藻的Rubisco的羧化酶活性的测定的详细方案，其是用于叶绿体研究的模式生物体和用于生物技术定向的酶的遗传操作的拟合宿主。 Rubisco必须与Mg 2+离子和碳酸氢盐预孵育以诱导催化活性中心（Laing和Christeller，1976）。一旦Rubisco被活化，本文所述的其羧化酶活性的测定基于将14 C-二氧化碳/碳酸氢盐固定在耐酸放射性中（Lorimer等人， ，1977）。虽然也可以使用分光光度测定法（Lilley和Walker，1974），但是当处理大量样品时，基于放射性底物固定的方法是不可替代的，并且它仍然是最常用于测定Rubisco活性的技术。
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| Purification of Rubisco from Chlamydomonas reinhardtii
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Author:
Date:
2015-12-05
[Abstract] Chlamydomonas reinhardtii is a model organism for chloroplast studies. Besides other convenient features, the feasibility of chloroplast genome transformation distinguishes this unicellular alga as ideal for the manipulation of chloroplastic gene expression aiming biotechnological goals, such as improved biofuel and biomass production. Ribulose 1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (EC 4.1.1.39, Rubisco) is the photosynthetic carbon-fixing enzyme which is considered crucial for biomass accumulation in algal cultures. Purification of wild type and site-directed mutants of Rubisco in C. reinhardtii is usually performed to study its catalytic properties and assess the carbon-fixing potential of the strains. In this protocol Rubisco is extracted through sonication of cell ...
[摘要] 衣藻衣原体是叶绿体研究的模式生物体。 除了其他方便的特点，叶绿体基因组转化的可行性区分这种单细胞藻理想的操纵叶绿体基因表达瞄准生物技术目标，如改善生物燃料和生物质生产。 核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（EC 4.1.1.39，Rubisco）是光合作用碳固定酶，其被认为对藻类培养物中的生物量累积是至关重要的。 Rubisco的野生型和定点突变体的纯化。 通常进行研究其催化性质并评估菌株的碳固定潜力。 在该方案中，通过细胞沉淀的超声处理提取Rubisco，并通过硫酸铵沉淀，蔗糖梯度离心（Goldwaithe和Bogorad，1975）和阴离子交换层析纯化。
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