| In vitro NLK Kinase Assay
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Author:
Date:
2017-11-05
[Abstract] This protocol provides step by step instructions to perform an in vitro kinase assay for nemo-like kinase. In addition, this protocol also describes an efficient method using mild lysis buffer for expression and purification of Glutathione S-transferase (GST) fusion proteins.
[摘要] 该协议提供了一步一步的指导，以进行nemo样激酶的体外激酶测定。 此外，该方案还描述了使用温和裂解缓冲液来表达和纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白的有效方法。
【背景】果蝇nemo已经被确定为在发育中的果蝇眼中光感受器簇的关键调节剂（Choi和Benzer，1994）。 据报道，nemo是不同物种间保守的。 该哺乳动物同系物是类似于Nemo的激酶（NLK）（Brott等人，1998; Rocheleau等人，1999）。 NLK是CMGC集团（CDK，MAPK，GSK3和CLK）的成员，也属于非典型的MAPK家族。 NLK通过转录因子调节多种细胞机制，所述转录因子包括在不同信号传导途径中的关键参与者TCF / LEF1，NICD和FOXO（Ishitani等人，1999; Ishitani等人， ，2010; Kim等人，2010）。 此外，最近我们已经将NLK鉴定为Yes相关蛋白（YAP）的新型激酶，YAP是Hippo途径中的共转录激活剂（Moon等人，2017）。 该协议描述了用于测量类似尼莫地来激酶活性的体外方法。
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| Isolation of Ribosomal Particles from the Unicellular Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803
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Author:
Date:
2017-03-20
[Abstract] Isolation of ribosomal particles is an essential step in the study of ribosomal components as well as in the analysis of trans-acting factors that interact with the ribosome to regulate protein synthesis and modulate the expression profile of the cell in response to different environmental conditions. In this protocol, we describe a procedure for the isolation of 70S ribosomes from the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 (hereafter Synechocystis). We have successfully used this protocol in our study of the cyanobacterial ribosomal-associated protein LrtA, which is a homologue of bacterial HPF (hibernation promoting factor) (Galmozzi et al., 2016).
[摘要] 核糖体颗粒的分离是研究核糖体组分以及与核糖体相互作用以调节蛋白质合成并调节细胞表达谱的反式因子的分析中必不可少的步骤响应不同的环境条件。在本协议中，我们描述了从单细胞蓝细菌集胞藻分离70S核糖体的过程。 PCC 6803（以下简称集胞藻）。我们已经成功地使用这个方案来研究蓝细菌核糖体相关蛋白LrtA，它是细菌HPF（冬眠促进因子）的同系物（Galmozzi等人，2016）。
背景 据报道蓝藻核糖体几乎没有生物化学研究。已经通过差速离心分离70S核糖体颗粒，然后通过二维电泳分析核糖体蛋白质（Sato et al。，et al。 ，1998）。核糖体也已经从聚球藻（Spechococcus）进行制备。 PCC 6301细胞使用组合差速离心和蔗糖步骤梯度的方案（Sugita等人，2000）。通过差速离心分离细胞提取物也被用于制备核糖体样品用于在不同的聚球藻菌株中开发体外翻译系统（Mutsuda和Sugiura，2006 ）。基于针对聚球藻（Sugita等人，2000）所述的方法，本文所述的针对集胞藻的方法允许使用以下方式纯化核糖体颗粒线性蔗糖梯度的超速离心。
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| Terminal Restriction Fragments (TRF) Method to Analyze Telomere Lengths
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Author:
Date:
2015-12-05
[Abstract] Chromosome ends - telomeres - are a focus of intensive research due to their importance for the maintenance of chromosome stability. Their shortening due to incomplete replication functions as a molecular clock counting the number of cell divisions, and ultimately results in cell-cycle arrest and cellular senescence. Determination of telomere lengths is an essential approach in telomere biology for research and diagnostic applications. Terminal Restriction Fragments (TRF) analysis is the oldest approach to analyze telomere lengths and remains the “gold standard” even in current studies. This technique relies on the fact that repeated minisatellite telomeric units do not contain target sites for restriction enzymes. Consequently, telomeres remain in relatively long fragments (TRF), whereas ...
[摘要] 染色体末端 - 端粒是密集研究的焦点，因为它们对维持染色体稳定性的重要性。它们由于不完全复制而缩短作为计数细胞分裂数目的分子时钟，最终导致细胞周期停滞和细胞衰老。端粒长度的测定是端粒生物学中用于研究和诊断应用的基本方法。末端限制性片段（TRF）分析是分析端粒长度的最古老的方法，并且即使在目前的研究中仍然是"金标准"。该技术依赖于重复的小卫星端粒单元不含有限制酶的靶位点的事实。因此，端粒保持相对长的片段（TRF），而基因组DNA被消化成短片段。然后通过与放射性标记的端粒探针杂交显现端粒DNA的片段。由于TRF除了端粒外还包括直到第一限制性位点的端粒相关DNA的短区域，结果稍微偏向更高的TRF值。因此，建议使用频繁的刀具或其混合物，以尽量减少这种差异。此外，通过使用TRF分析，可以区分真正（末端）端粒与间质端粒重复（ITR）（Richards和Ausubel，1988）。在该方法中，首先将BAL31消化应用于高分子量DNA。酶从其末端逐渐降解线性DNA。然后用一种或多种限制酶消化降解的DNA，并通过凝胶电泳分离片段。印迹后，用末端标记序列或端粒序列探测膜。真正的TRF可以区别于ITR，因为它们随着BAL31消化时间的增加而逐步缩短，而ITR是BAL31抗性的。在时间零时的TRF BAL31消化模式表示近似端粒长度（Fajkus等人，2005）。
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