| Lipid Droplet Isolation from Arabidopsis thaliana Leaves
|
|
Author:
Date:
2020-12-20
[Abstract] Lipid droplets (LDs) are neutral lipid aggregates surrounded by a phospholipid monolayer and specific proteins. In plants, they play a key role as energy source after seed germination, but are also formed in vegetative tissues in response to developmental or environmental conditions, where their functions are poorly understood. To elucidate these, it is essential to isolate LDs with good yields, while retaining their protein components. LD isolation protocols are based on their capacity to float after centrifugation in sucrose gradients. Early strategies using stringent conditions and LD-abundant plant tissues produced pure LDs where core proteins were identified. To identify more weakly bound LD proteins, recent protocols have used low stringency buffers, but carryover contaminants and ...
[摘要] [摘要]脂质滴（LDs）是被磷脂单层和特定蛋白质包围的中性脂质聚集体。在植物中，它们在种子发芽后作为能源起着关键作用，但由于发育或环境条件而对其功能了解甚少，它们也在营养组织中形成。为了阐明这些，必须分离出具有高产率的LD，同时保留其蛋白质成分。LD分离方案基于其在蔗糖梯度中离心后的漂浮能力。早期使用严格条件和LD丰富的植物组织的策略产生了可鉴定核心蛋白的纯LD。为了鉴定更弱结合的LD蛋白，最近的研究otocols使用了低严格性的缓冲液，但是残留污染物和低收率通常是个问题。我们已经开发了一种基于蔗糖梯度的方案，可使用Tween-20和新鲜组织从拟南芥叶中分离LD，以提高产量。在健康和细菌感染的拟南芥叶片中，该方案均允许鉴定LD蛋白，随后通过显微镜分析对其进行确认。
背景]脂质降住所（LD）的通过由磷脂单层，其中LD蛋白插入包围的中性脂质核心组成的细胞器（Tzen等人，1993） 。LD首先被描述为稳定的隔室，用于在特殊组织中存储高能脂质。然而，最近的评论将LDs描述为大多数细胞类型中存在的高度动态的细胞器，其功能超越了单纯的能量存储（Shimada等人，2018; Huang，2018; Shao等人，2019）。
...
|
|
|
| Isolation of Cytosol, Microsome, Free Polysomes (FPs) and Membrane-bound Polysomes (MBPs) from Arabidopsis Seedlings
|
|
Author:
Date:
2017-08-05
[Abstract] The plant endomembrane system plays vital roles for synthesis, modification and secretion of proteins and lipids. From the classic view, only mRNAs encoding secreted proteins could be targeted to the endoplasmic reticulum (ER) for translation via a co-translational translocation manner, however, recently this model has been challenged by accumulative evidence that lots of cytosolic mRNAs could also associate with ER, and that some categories of small RNAs are enriched on ER. These results suggested unrevealed functions of ER beyond our current knowledge. The large scale identification of RNAs and proteins on microsome is crucial to demonstrating the ER function and the studies will be boosted by next generation sequencing technology. This protocol provides a technical workflow to isolate ...
[摘要] 植物内膜系统对蛋白质和脂质的合成，修饰和分泌起着至关重要的作用。 从经典观点来看，只有编码分泌蛋白质的mRNA才能通过协同翻译方式靶向内质网（ER）进行翻译，然而最近，这一模型已经被大量的细胞溶质mRNA也可能与 ER，并且一些类别的小RNA在ER上富集。 这些结果表明ER的功能超出了目前的知识。 在微粒体上大规模鉴定RNA和蛋白质对于显示ER功能至关重要，研究将由下一代测序技术提升。 该协议提供了从植物组织中分离细胞质，微粒体，游离多聚体（FP）和膜结合多聚体（MBP）的技术工作流程。 分离的级分适用于mRNA，小RNA和蛋白质的基因组广谱分析。
【背景】植物内膜系统对于细胞壁形成，脂质生物合成，蛋白质合成，修饰，折叠和贩运非常重要。根据共翻译易位模型，分泌蛋白N末端的信号肽由细胞溶质多核糖体合成，然后由ER上的信号识别粒子识别，其余蛋白质部分随后在ER上合成。根据该模型，只有编码分泌蛋白的mRNA可以被带到ER进行翻译（Peter和Johnson，1994）。然而，从哺乳动物和植物细胞ER（Lerner等人，2003; de ...
|
|
|
| A Ribosome Footprinting Protocol for Plants
|
|
Author:
Date:
2016-11-05
[Abstract] Ribosome footprinting, or Ribo-seq, has revolutionized the studies of translation. It was originally developed for yeast and mammalian cells in culture (Ingolia et al., 2009). Herein, we describe a plant-optimized hands-on ribosome footprinting protocol derived from previously published procedures of polysome isolation (Ingolia et al., 2009; Mustroph et al., 2009) and ribosome footprinting (Ingolia et al., 2009; Ingolia et al., 2013). With this protocol, we have been able to successfully isolate and analyze high-quality ribosomal footprints from different stages of in vitro grown Arabidopsis thaliana plants (dark-grown seedlings [Merchante et al., 2015] and 13-day-old plantlets in plates and plants grown in liquid ...
[摘要] 核糖体足迹或Ribo-seq，彻底改变了翻译研究。它最初是为培养中的酵母和哺乳动物细胞开发的（Ingolia等人，2009）。本文中，我们描述了来自先前公开的多核糖体分离程序的植物优化的亲手核糖体印迹方案（Ingolia等人，2009; Mustroph等人，2009 ）和核糖体印迹（Ingolia等人，2009; Ingolia等人，2013）。使用该协议，我们能够成功地分离和分析来自体外生长的拟南芥植物（黑暗生长的幼苗）的不同阶段的高质量核糖体印迹[Merchante < ，以及在液体培养物中生长的板和植物中的13天龄小植物[未发表的结果]）。
[背景] 翻译在调节基因活性中的中心作用早已被公认，但是在响应于特定刺激的全基因组翻译定量变化的系统探索最近才变得技术上可行。最初为培养中的酵母和哺乳动物细胞开发的核糖体印迹技术（通常称为Ribo-seq）已经彻底改变了翻译调节和基因表达的研究，因为其允许确定核糖体在基因组 - ...
|
|
|