| Gliding Assay to Analyze Microtubule-based Motor Protein Dynamics
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] The purpose of this protocol is to provide an updated method of performing microtubule gliding assays and visualizing it using fluorescence microscopy.
[摘要] 该协议的目的是提供一种更新的微管滑翔测定方法，并使用荧光显微镜对其进行可视化。
有丝分裂主轴是主导有丝分裂的蛋白质机械。有丝分裂纺锤体利用基于微管的运动蛋白来组织自身，并施加力量驱动细胞分裂。基于微管的运动蛋白使用源自ATP水解的能量产生机械工作（Coppin等人，1997）。运动蛋白以单向方式转移微管。运动的行为可以通过体外滑行测定（Tao和Scholey，2010）来观察，其中将电机固定在玻璃表面上并提供微管和ATP。然后可以使用荧光显微镜研究运动蛋白的运动性，并且可以实时观察其动态行为的细节。该更新的方案将允许使用体外微管滑动测定法（Tao等人，2006和2016）分析基于微管的运动蛋白功能。
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| In vitro Microtubule Bundling Assay under Physiological Conditions
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] Kinesins play a role in organizing the mitotic spindle through the crosslinking of microtubules (MTs), made possible through binding sites at opposite ends of the holoenzyme. Here, we developed a method to test kinesin MT crosslinking action under physiological conditions.
[摘要] 驱动蛋白通过微管（MT）的交联来组织有丝分裂纺锤体，通过在全酶的相对端的结合位点成为可能。在这里，我们开发了一种在生理条件下测试驱动蛋白MT交联作用的方法。
基于微管的运动蛋白是重要的，因为它们使用ATP的化学能产生力以便向量转移微管（MT）。在这些基于MT的运动蛋白中，称为驱动蛋白的超家族负责定向运输和沿微管的运动。一些运动蛋白在全酶的两端具有MT结合位点，因此它们可以在生理ATP条件下将MT交联成束（Tao等人，2006）。由于这种捆绑活动，它们在组织和维持有丝分裂纺锤体方面具有重要作用，其主要作用取决于其微管的极性模式（van den Wildenberg等人，2008）。以前的捆绑测定不包括ATP，或者使用可以产生人为结果的不可水解的ATP类似物。这里我们开发了一种使用生理ATP条件的方法。通过纯化这些全长运动蛋白，它使我们能够在生理条件下测定其交联活性。
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| Determination of Cellular Phosphatidylinositol-3-phosphate (PI3P) Levels Using a Fluorescently Labelled Selective PI3P Binding Domain (PX)
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Author:
Date:
2016-08-20
[Abstract] The lipid Phosphatidylinositol-3-phosphate [PtdIns3P or PI(3)P] plays many membrane trafficking roles and is primarily produced by the Class III PI3K, VPS34. Determining the level of cellular PI(3)P however can be complex. Extraction of cellular lipids by methanol/chloroform can struggle to separate and identify distinct phospholipid species. Alternately mass spectrometry may be utilised but this requires significant set up of specialised equipment and time to utilise.
Use of a PI(3)P-binding-specific recombinant protein domain is a quick method for ascertaining cellular PI(3)P levels and can also allow visualisation of sub-cellular localisation. The PX domain of p40phox (herein referred to as PX) is very specific for PI(3)P over other phospholipid species (Kanai et al., ...
[摘要] 脂质磷脂酰肌醇-3-磷酸[PtdIns3P或PI（3）P]扮演许多膜贩运角色，主要由III类PI3K，VPS34产生。然而，确定细胞PI（3）P的水平可以是复杂的。通过甲醇/氯仿提取细胞脂质可能难以分离和鉴定不同的磷脂种类。或者可以使用质谱法，但这需要大量设置专门的设备和时间来利用。
使用PI（3）P结合特异性重组蛋白结构域是用于确定细胞PI（3）P水平的快速方法，并且还可以允许亚细胞定位的可视化。 p40phox的PX结构域（本文称为PX）对PI（3）P比其它磷脂种类非常特异（Kanai等人，2001）。然而，在细胞中直接表达PX可能是有问题的，因为它将以显性负性方式作用，以比内源蛋白更大的亲和力结合和螯合PI（3）P，从而干扰细胞途径和PI（3）P水平。因此，使用荧光标记的PX后细胞固定更合适，因为它能突出显示PI（3）富集结构，没有扰乱系统的风险。
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