| Targeted Mutagenesis Using RNA-guided Endonucleases in Mosses
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Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] RNA-guided endonucleases (RGENs) have been used for genome editing in various organisms. Here, we demonstrate a simple method for performing targeted mutagenesis and genotyping in a model moss species, Physcomitrella patens, using RGENs. We also performed targeted mutagenesis in a non-model moss, Scopelophilla cataractae, using a similar method (Nomura et al., 2016), indicating that this experimental system could be applied to a wide range of mosses species.
[摘要] RNA引导的核酸内切酶（RGENs）已被用于各种生物体的基因组编辑。 在这里，我们展示了使用RGENs在模型苔藓种类小立碗藓中进行定向诱变和基因分型的简单方法。 我们还使用类似的方法（Nomura等，2016）在非模型苔藓，Scopelophilla白内障中进行了定向诱变，表明该实验系统可以应用于广泛的苔藓物种。
【背景】使用来自适应性免疫系统的RNA引导内切核酸酶（RGEN）的靶向诱变，使用细菌CRISPR（定期间隔的回文重复序列）/ Cas（CRISPR相关）系统近年来已经急剧发展。在该方法中，使用源自化脓性链球菌的Cas9核酸内切酶和人工设计的单链导向RNA（sgRNA）。 Cas9-sgRNA复合物识别原始相邻基序（5'-NGG-3'），并在目标位点上游3 bp切割（Jinek等，2012）。随后，在DNA的双链断裂（DSB）修复过程中发生随机插入和/或缺失突变。使用这些RGEN的定向诱变是有效的以及成本和时间有效的，它已被用于各种生物体（包括许多植物物种）的基因组编辑。在这里，我们在青苔中建立了使用RGEN进行靶向诱变的方案，并在模型和非模型物种中进行了证明（Nomura等，2016）。
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| Analysis of the Virulence of Uropathogenic Escherichia coli Strain CFT073 in the Murine Urinary Tract
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Author:
Date:
2017-02-05
[Abstract] This urinary tract infection model was used to monitor the efficacy of a new virulence factor of the uropathogenic Escherichia coli strain CFT073 in vivo. The new virulence factor which we designated TIR-containing protein C (TcpC) blocks Toll-like receptor signaling and the NLRP3 inflammasome signaling cascade by interacting with key components of both pattern recognition receptor systems (Cirl et al., 2008; Waldhuber et al., 2016). We infected wild type and knock-out mice with wildtype CFT073 and a mutant CFT073 strain lacking tcpC. This protocol describes how the mice were infected, how CFT073 was prepared and how the infection was monitored. The protocol was derived from our previously published work and allowed us to demonstrate that TcpC ...
[摘要] 该尿路感染模型被用于监测新生的致病性大肠杆菌菌株CFT073在体内的功效。我们指定含TIR的蛋白C（TcpC）的新的毒力因子通过与模式识别受体系统的关键组分相互作用来阻断Toll样受体信号传导和NLRP3炎性信号级联反应（Cirl等人）。 ，2008; Waldhuber等人，2016）。我们用野生型CFT073和缺乏tcpC的突变体CFT073菌株感染野生型和敲除小鼠。该协议描述了小鼠如何感染，如何制备CFT073以及如何监测感染。该方案源于我们以前发表的工作，并允许我们证明TcpC是一种强大的毒力因子，通过增加CFT073在尿液和肾脏中的细菌负担。此外，TcpC负责肾脓肿的发展，因为感染具有野生型但不是tcpC的缺乏CFT073突变体的小鼠引起这种并发症。
背景 尿路感染（UTIs）是全世界最常见的细菌感染（Dielubanza和Schaeffer，2011），主要是由欧洲病原大肠杆菌（UPEC）引起的（Zhang和Foxman，2003）。复发性感染率高（Dielubanza和Schaeffer，2011），抗生素抗性E的出现也有所增加。大肠杆菌菌株（Eurosurveillance editorial，2015）。因此，为了开发新的治疗剂，对宿主和细菌因子对尿路感染病理生理学的了解具有很高的相关性。
＆nbsp;鼠类UTI模型系统是主要使用的动物模型系统，用于研究UPEC分离株和细菌 ...
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| Sample Preparation of Telomerase Subunits for Crystallization
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Author:
Date:
2015-08-20
[Abstract] Telomerase is a large ribonucleoprotein complex that replicates the linear chromosome ends in most eukaryotes. Large-scale preparation of the telomerase core components in vitro has long been a big challenge in this field, hindering the understanding of the catalytic mechanism of telomerase, as well as slowing down the development of telomerase inhibitors for cancer therapy. We have successfully developed a protocol for large-scale preparation of the TRBD-CR4/5 complex of the medaka telomerase in vitro, and used this method to study the high-resolution structure of the TRBD-CR4/5 complex by X-ray crystallography. This procedure may be also adapted to purify other protein-RNA complexes for structural studies.
[摘要] 端粒酶是在大多数真核生物中复制线性染色体末端的大核糖核蛋白复合物。 体外大规模制备端粒酶核心组分长期以来一直是该领域的一个大挑战，阻碍了对端粒酶的催化机理的理解，以及减慢端粒酶抑制剂对癌症的发展 治疗。 我们成功地开发了用于大规模制备体外的medaka端粒酶的TRBD-CR4/5复合物的方案，并且使用该方法研究TRBD-CR4/5复合物的高分辨率结构， 5复合物通过X射线晶体学。 该程序也可以适于纯化其它蛋白质-RNA复合物用于结构研究。
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