| Quantification of the Surface Expression of G Protein-coupled Receptors Using Intact Live-cell Radioligand Binding Assays
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Author:
Date:
2020-09-20
[Abstract] G protein-coupled receptors (GPCRs) are the most structurally diverse family of signaling proteins and regulate a variety of cell function. For most GPCRs, the cell surface is their functional destination where they are able to respond a wide range of extracellular stimuli, leading to the activation of intracellular signal transduction cascades. Thus, the quantity of receptor expression at the cell surface is a crucial factor regulating the functionality of the receptors. Over the past decades, many methods have been developed to measure the cell surface expression of GPCRs. Here, we describe an intact live-cell radioligand binding assay to quantify the surface expression of GPCRs at the endogenous levels or after overexpression. In this assay, cell cultures will be incubated with ...
[摘要] [摘要] G蛋白偶联受体（GPCR）是信号蛋白中结构最多样化的家族，可调节多种细胞功能。对于大多数GPCR，细胞表面是它们的功能目的地，能够响应广泛的细胞外刺激，从而激活细胞内信号转导级联反应。因此，受体在细胞表面的表达量是调节受体功能的关键因素。在过去的几十年中，已开发出许多方法来测量GPCR的细胞表面表达。在这里，我们描述了完整的活细胞放射性配体结合测定法，以量化内源水平或过表达后GPCR的表面表达。在该测定中，将细胞培养物与特定的细胞不可渗透的放射性配体温育，所述放射性不可配体选择性地和化学计量地结合至各个GPCR，并且通过受体结合的配体的放射性来定量细胞表面的受体数量。 此方法对于测量完整活细胞表面的功能性GPCR具有高度特异性，对于内源性，低丰度的GPCR特别有用。
[背景 ] G蛋白偶联受体（GPCR）构成细胞表面受体的最大超家族，并在生理和病理条件下调节多种细胞功能（Hauser 等人，2017; Hilger 等人，2018; Weinberg和Puthenveedu，2019） ...
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| FACS-based Glucose Uptake Assay of Mouse Embryonic Fibroblasts and Breast Cancer Cells Using 2-NBDG Probe
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Author:
Date:
2018-04-20
[Abstract] This is a flow cytometry-based protocol to measure glucose uptake of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and breast cancer cells in vitro. The method is a slightly modified and updated version as previously described (Dong et al., 2017). Briefly, the target cells are incubated with the fluorescently tagged 2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) for 2 h or 30 min, and the efficiency of glucose uptake is examined using a flow cytometer. This method can be adapted to measure a variety of adipocytes, immune cells, MEFs and cancer cells.
[摘要] 这是一种基于流式细胞术的方法，用于在体外测量小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）和乳腺癌细胞的葡萄糖摄取。 该方法是稍微修改和更新的版本（Dong等人，2017）。 简言之，将靶细胞与荧光标记的2-（N-（7-硝基苯-2-基-1,3-二唑-4-基）氨基）-2-脱氧葡萄糖（2-NBDG）一起温育2小时或 30分钟，并使用流式细胞仪检查葡萄糖摄取的效率。 该方法可适用于测量各种脂肪细胞，免疫细胞，MEF和癌细胞。
【背景】葡萄糖是细胞的主要能量来源。葡萄糖转运蛋白家族（GLUT）负责跨葡萄糖转运葡萄糖（Kohn等人，1996）。葡萄糖摄取的变化可以反映细胞代谢的变化。例如，肿瘤细胞通常使用葡萄糖进行有氧糖酵解以支持其快速增殖。通常，与正常细胞相比，肿瘤细胞具有增加的葡萄糖摄取速率（Vander Heiden等人，2009）。 2-脱氧葡萄糖（2DG）是一种葡萄糖类似物，它以2-脱氧葡萄糖-6-磷酸（2DG6P）的形式积累在细胞中。 2DG6P长期以来一直是测量葡萄糖摄取的黄金标准（Yamamoto et al。，2011）。尽管放射性标记的2DG6P的测量是敏感的，但许多研究人员避免了这种方法，因为放射性物质的处理和处置需要特殊的程序。
另一种不可代谢的葡萄糖类似物是荧光标记的2-（N-（7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑-4-基）氨基）-2-脱氧葡萄糖（2-NBDG）。该分子通过葡萄糖转运蛋白积聚在活细胞中，不会进入糖酵解途径。 ...
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| Reversible Cryo-arrests of Living Cells to Pause Molecular Movements for High-resolution Imaging
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Author:
Date:
2017-04-20
[Abstract] Fluorescence live-cell imaging by single molecule localization microscopy (SMLM) or fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) in principle allows for the spatio-temporal observation of molecular patterns in individual, living cells. However, the dynamics of molecules within cells hamper their precise observation. We present here a detailed protocol for consecutive cycles of reversible cryo-arrest of living cells on a microscope that allows for a precise determination of the evolution of molecular patterns within individual living cells. The usefulness of this approach has been demonstrated by observing ligand-induced clustering of receptor tyrosine kinases as well as their activity patterns by SMLM and FLIM (Masip et al., 2016).
[摘要] 通过单分子定位显微镜（SMLM）或荧光寿命成像显微镜（FLIM）的荧光活细胞成像原理上允许在个体，活细胞中的分子模式的时空观察。然而，细胞内分子的动力学阻碍了它们的精确观察。我们在这里介绍一个详细的方案，用于显微镜上活细胞可逆冷冻停滞的连续循环，允许精确测定各个活细胞内分子模式的演变。通过观察受体酪氨酸激酶的配体诱导的聚集以及SMLM和FLIM的活性模式已经证明了该方法的有用性（Masip等人，2016）。
了解细胞中的分子过程，例如受体 - 酪氨酸激酶（RTK）的配体诱导反应需要精确的时空观察分子模式。由于细胞状态的差异，这种反应需要在个体细胞而不是细胞群体中进行监测（Snijder和Pelkmans，2011）。使用SMLM，各个分子可以以高精度进行定位（Betzig等人，2006）。这允许例如提取关于质膜中的RTK聚类的信息。互补地，共焦FLIM可以揭示分子如何在衍射受限体积元素内作为整体反应。这可以通过使用构象传感器揭示RTK与下游分子的相互作用模式，磷酸化模式以及活性模式（Offterdinger等人，2004; Sabet等人）。 ...
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