| Detection of Intracellular Reduced (Catalytically Active) SHP-1 and Analyses of Catalytically Inactive SHP-1 after Oxidation by Pervanadate or H2O2
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Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] Oxidative inactivation of cysteine-dependent Protein Tyrosine Phosphatases (PTPs) by cellular reactive oxygen species (ROS) plays a critical role in regulating signal transduction in multiple cell types. The phosphatase activity of most PTPs depends upon a ‘signature’ cysteine residue within the catalytic domain that is maintained in the de-protonated state at physiological pH rendering it susceptible to ROS-mediated oxidation. Direct and indirect techniques for detection of PTP oxidation have been developed (Karisch and Neel, 2013). To detect catalytically active PTPs, cell lysates are treated with iodoacetyl-polyethylene glycol-biotin (IAP-biotin), which irreversibly binds to reduced (S-) cysteine thiols. Irreversible oxidation of SHP-1 after treatment of cells with ...
[摘要] 细胞活性氧（ROS）对半胱氨酸依赖性蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）的氧化失活在调节多种细胞类型的信号转导中起关键作用。大多数PTP的磷酸酶活性取决于催化结构域内的“标记”半胱氨酸残基，其在生理pH下保持质子化状态，使其易受ROS介导的氧化。已经开发了用于检测PTP氧化的直接和间接技术（Karisch和Neel，2013）。为了检测催化活性的PTP，用碘乙酰 - 聚乙二醇 - 生物素（IAP-生物素）处理细胞裂解物，所述碘乙酰 - 聚乙二醇 - 生物素（IAP-生物素）不可逆地结合还原的（S-5）半胱氨酸硫醇。使用对磺酸（SO 3）特异性的抗体检测用过钒酸盐或H 2 O 2 2处理细胞后SHP-1的不可逆氧化， H）形式的PTP的保守的活性位点半胱氨酸。在该协议中，我们描述了用于检测造血PTP SHP的还原（S ; active）或不可逆氧化（SO 3 H;非活性）形式的方法-1，尽管这种方法适用于任何细胞类型中的任何半胱氨酸依赖性PTP。
【背景】活性氧（ROS）由细胞NADPH氧化酶和线粒体产生。大多数蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTP）含有保守的催化半胱氨酸，其具有低的解离常数（pKa），其对ROS的氧化非常敏感（Rudyk和Eaton，2014）。 PTP的ROS失活在许多细胞类型中调节酪氨酸激酶介导的信号传导反应中起重要作用。在用ROS H 2 O ...
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| Detection of ASC Oligomerization by Western Blotting
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Author:
Date:
2017-05-20
[Abstract] The apoptosis-associated speck-like protein with a caspase-recruitment domain (ASC) adaptor protein bridges inflammasome sensors and caspase-1. Upon inflammasome activation, ASC nucleates in a prion-like manner into a large and single platform responsible for the recruitment and the activation of caspase-1. Active caspase-1 will in turn promote the proteolytic maturation of the pro-inflammatory cytokine IL-1β. ASC oligomerization is direct evidence for inflammasome activation and its detection allows a read-out independent of caspase-1 and IL-1β. This protocol describes how to detect the oligomerization of ASC by Western blot.
[摘要] 具有半胱天冬酶募集区（ASC）衔接蛋白的凋亡相关斑点样蛋白桥联炎症体传感器和半胱天冬酶-1。在炎性体活化后，ASC以类似朊病毒的方式成核，成为负责募集和激活半胱天冬酶-1的大而单一的平台。活性胱天蛋白酶-1将反过来促进促炎细胞因子IL-1β的蛋白水解成熟。 ASC寡聚化是炎性体激活的直接证据，其检测允许读取与caspase-1和IL-1β无关。该方案描述了如何通过蛋白质印迹检测ASC的寡聚化。
背景 Inflammasomes是大量的多蛋白平台，其感测各种微生物，内源和环境胁迫因子，导致促炎IL-1细胞因子家族的成熟（Martinon等人，2002; Sharma和Kanneganti， 2016）。激活后，炎性细胞传感器通过pyrin结构域（PYD）-PYD同型相互作用募集衔接蛋白ASC。 ASC通过胱天蛋白酶激活和募集域（CARD）-CARD相互作用又结合半胱天冬酶-1，并有利于caspase-1的自我蛋白水解切割，导致IL-1β和IL-18的成熟（Hoss等人。，2016）。 Inflammasome激活引发ASC二聚体的超分子寡聚化成称为“ASC-specks”或“pyroptosome”（Fernandes-Alnemri等人，2007）的大交织原纤维。 ASC-speck / ...
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| RNA Strand Displacement Assay for Hepatitis E Virus Helicase
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Date:
2017-04-05
[Abstract] The hepatitis E virus (HEV) helicase uses ATP to unwind the RNA duplexes. This is an essential step for viral replication. This protocol aims to measure the double strand RNA unwinding activity of the HEV helicase.
[摘要] 乙型肝炎病毒（HEV）解旋酶使用ATP来解开RNA双链体。 这是病毒复制的重要步骤。 该方案旨在测量HEV解旋酶的双链RNA展开活性。
已经使用放射性标记的双链RNA（dsRNA，Karpe等人，2010）测量了HEV解旋酶的RNA展开活性。 我们已经建立了用于测量HEV解旋酶的dsRNA展开活性的非放射性测定方案。 该测定利用荧光标记的RNA来测量从人肝癌细胞纯化的HEV解旋酶蛋白的活性，从而消除了处理放射性物质的需要。
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