| In vivo Analysis of Cyclic di-GMP Cyclase and Phosphodiesterase Activity in Escherichia coli Using a Vc2 Riboswitch-based Assay
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Author:
Date:
2018-03-05
[Abstract] Cyclic di-guanosine monophosphate (c-di-GMP) is a ubiquitous second messenger that regulates distinct aspects of bacterial physiology. It is synthesized by diguanylate cyclases (DGCs) and hydrolyzed by phosphodiesterases (PDEs). To date, the activities of DGC and PDE are commonly assessed by phenotypic assays, mass spectrometry analysis of intracellular c-di-GMP concentration, or riboswitch-based fluorescent biosensors. However, some of these methods require cutting-edge equipment, which might not be available in every laboratory. Here, we report a new simple, convenient and cost-effective system to assess the function of DGCs and PDEs in E. coli. This system utilizes the high specificity of a riboswitch to c-di-GMP and its ability to regulate the expression of a downstream ...
[摘要] 环状二磷酸鸟苷（c-di-GMP）是一种无处不在的第二信使，它调节细菌生理学的不同方面。 它由diguanylate环化酶（DGC）合成并被磷酸二酯酶（PDE）水解。 迄今为止，通常通过表型分析，细胞内c-di-GMP浓度的质谱分析或基于核糖开关的荧光生物传感器来评估DGC和PDE的活性。 但是，其中一些方法需要尖端设备，而这些设备可能不适用于每个实验室。 在这里，我们报告了一个新的简单，方便和具有成本效益的系统，用于评估E中DGC和PDE的功能。大肠杆菌。 该系统利用核糖开关对c-di-GMP的高特异性及其响应于c-di-GMP浓度而调节下游β-半乳糖苷酶报道基因的表达的能力。 在该协议中，我们描述了该系统的构建及其用于评估DGC和PDE酶的活性。
【背景】Cyclic-di-GMP是细菌中重要且无处不在的第二信使，其调节各种过程，例如运动到衰退转变，生物膜形成，毒力和细胞周期进展（Römling等人， ，2013）。 GG（D / ...
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| Extraction, Purification and Quantification of Diffusible Signal Factor Family Quorum-sensing Signal Molecules in Xanthomonas oryzae pv. oryzae
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Date:
2017-03-20
[Abstract] Bacteria use quorum-sensing (QS) systems to monitor and regulate their population density. Bacterial QS involves small molecules that act as signals for bacterial communication. Many Gram-negative bacterial pathogens use a class of widely conserved molecules, called diffusible signal factor (DSF) family QS signals. The measurement of DSF family signal molecules is essential for understanding DSF metabolic pathways, signaling networks, as well as regulatory roles. Here, we describe a method for the extraction of DSF family signal molecules from Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) cell pellets and Xoo culture supernatant. We determined the levels of DSF family signals using ultra-performance liquid chromatographic system (UPLC) coupled with accurate mass ...
[摘要] 细菌使用群体感知（QS）系统监测和调节其人口密度。细菌QS涉及作为细菌通信信号的小分子。许多革兰氏阴性细菌病原体使用一类广泛保守的分子，称为扩散信号因子（DSF）家族QS信号。 DSF家族信号分子的测量对于了解DSF代谢途径，信号网络以及调节作用至关重要。在这里，我们描述了从Xanthomonas oryzae pv提取DSF家族信号分子的方法。 （ Xoo ）细胞沉淀和Xoo 培养上清液。我们使用超高效液相色谱系统（UPLC）与准确的质量飞行时间质谱仪（TOF-MS）联合测定DSF家族信号的水平。在UPLC / MS系统的帮助下，DSF的检测限低至1μM，大大提高了在细菌培养和反应混合物中检测DSF DSF家族信号分子的能力。
背景 黄单胞菌属 oryzae pv。米糠X ae））））））））））y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y y十二碳烯酸（DSF），顺式-2-十二碳烯酸（BDSF），顺式-10-甲基-2-十二碳烯酸（IDSF）和顺式<顺式 -11-甲基十二烷-2,5-二烯酸（CDSF），以调节毒力因子产生（图1）。 DSF家族信号的生物合成，感知和周转需要Xoo 中的rpf ...
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| Single Cell Flow Cytometry Assay for Peptide Uptake by Bacteria
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Author:
Date:
2016-12-05
[Abstract] Antimicrobial peptides (AMPs) can target the bacterial envelope or alternatively have intracellular targets. The latter requires uptake of the peptide by the bacterial cells. The bacterial internalization of an AMP can be evaluated by a fluorescence-based method that couples the use of the fluorescently labelled AMP to the fluorescence quencher trypan blue. Trypan blue is excluded from the interior of intact cells and the fluorescence of the extracellular peptide or of the peptide bound on the bacterial surface can be quenched by it, while the fluorescence of the internalized peptide is not affected. The uptake of the peptide by the bacteria is determined by measuring the fluorescence in individual cells by flow cytometry.
[摘要] 抗微生物肽（AMP）可靶向细菌包膜或者具有细胞内靶标。后者需要细菌细胞摄取肽。 AMP的细菌内化可以通过基于荧光的方法来评估，所述方法将荧光标记的AMP的使用耦合到荧光猝灭剂台盼蓝。台盼蓝从完整细胞的内部排除，并且细胞外肽或结合在细菌表面上的肽的荧光可被其淬灭，而内化肽的荧光不受影响。通过用流式细胞术测量单个细胞中的荧光来测定细菌对肽的吸收。
关键词：抗微生物肽，流式细胞术，肽摄取，肽转运蛋白，台盼蓝，碘化物吸收量
[背景] AMP由广泛且多样的有效抗微生物剂组成，具有作为新型治疗剂的潜力（Wang等人）。 ，2015）。 AMP是天然免疫的一部分并且由所有王国的生物产生。它们被这些生物体动员以抵抗感染的微生物，其可以是细菌，真菌或病毒。他们这样做通过直接杀死微生物，但他们也可以作为哨兵，促进其他免疫途径。有趣的是，还已经清楚的是，AMP不仅是针对不良微生物的药剂，而且它们还在动物和植物宿主中共生细菌群体的控制中具有关键作用（Maróti等人，2011 ; Kondorosi et al 。，2013）。
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