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Author:
Yong-Wei Zhang, Rochelle E. Nasto, Sandra A. Jablonski, Ilya G Serebriiskii, Rishi Surana, Joseph Murray, Michael Johnson, Rebecca B. Riggins, Robert Clarke, Erica A. Golemis and Louis M. Weiner,
Date:
2017-08-05
[Abstract] RNAi screening technology has revealed unknown determinants of various biological signaling pathways in biomedical studies. This protocol provided detailed information about how to use RNAi screening to identify proliferation determinants in breast tumor cells. siRNA-based libraries targeting against Estrogen receptor (ER)-network, including 631 genes
relevant to estrogen signaling, was constructed for screening in breast cancer cells. Briefly, reverse transfection of siRNA induced transient gene knockdown in MCF7 cells. First, the transfection reagent for MCF7 cells was selected. Next, the Z’-score assay was used to monitor if screening conditions yielded efficiently. Then, the ER-network siRNA library screening was preceded by automatic machines under optimized experimental conditions.
[摘要] RNAi筛选技术已经揭示了生物医学研究中各种生物信号通路的未知决定因素。 该协议提供了有关如何使用RNAi筛选来鉴定乳腺肿瘤细胞中增殖决定簇的详细信息。 基于siRNA的文库针对雌激素受体（ER） - 网络，包括631个基因
与雌激素信号相关，构建用于筛选乳腺癌细胞。 简单地说，siRNA在MCF7细胞中的逆转染诱导瞬时基因敲低。 首先选择MCF7细胞转染试剂。 接下来，使用Z'评分测定来监测筛选条件是否有效产生。 然后，在优化的实验条件下，ER-网络siRNA文库筛选之前是自动机器。
【背景】RNA干扰（RNAi）是一种生物过程，可通过引发特异性mRNA分子的破坏而被利用来抑制基因表达。通过RNAi技术敲除特定基因通常与表型变化相关联，这使得RNAi广泛用于生命科学研究。两种系统用于高通量RNAi筛选，一种是基于慢病毒的短发夹RNA（shRNA）文库筛选;另一种是基于化学合成的小干扰RNA（siRNA）筛选（Boutros等人，2008）。基于ShRNA的转染诱导细胞中稳定的基因敲低。基于siRNA的转染诱导瞬时基因敲低。慢病毒合并的shRNA文库含有针对基因组DNA或一组基因的shRNA的慢病毒。需要进行以下分析以区分筛选后的靶基因，例如基于芯片的DNA微阵列或下一代测序（NGS）。然而，在基于siRNA的文库中，针对每个单个靶基因的siRNA分布在96孔或384孔板的每个孔中。 ...
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