| Dense sgRNA Library Construction Using a Molecular Chipper Approach
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Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] Genetic screens using single-guide-RNA (sgRNA) libraries and CRISPR technology have been powerful to identify genetic regulators for both coding and noncoding regions of the genome. Interrogating functional elements in noncoding regions requires sgRNA libraries that are densely covering, and ideally inexpensive, easy to implement and flexible for customization. We present a Molecular Chipper protocol for generating dense sgRNA libraries from genomic regions of interest. This approach utilizes a combination of random fragmentation and a Type III restriction enzyme to derive a dense coverage of sgRNA library from input DNA.
[摘要] 使用单导向RNA（sgRNA）文库和CRISPR技术的遗传筛选功能强大可以识别基因组编码区和非编码区的遗传调控因子。 在非编码区域中询问功能元件需要密集覆盖的sgRNA文库，理想的便宜，易于实现和灵活定制。 我们提出了一个分子切片方案从感兴趣的基因组区域产生密集的sgRNA文库。 该方法利用随机断裂和III型限制酶的组合从输入DNA导出sgRNA文库的致密覆盖。
【背景】使用化脓性链球菌（sp）的基因组编辑Cas9和sgRNA文库是通过产生双重缺失功能序列改变来筛选哺乳动物细胞功能性遗传调节因子的有力工具（Wiedenheft et al。，2012; Mali et al。，2013; Koike-Yusa等，2014; Shalem等，2014; Wang等，2014; Zhou等，2014）。 Cas9结合sgRNA，其可被设计为将Cas9靶向基因组中定义的基因座。 Cas9的核酸酶活性切割靶DNA位点，导致双链DNA断裂，在通过非同源末端连接途径进行DNA修复时，经常导致感兴趣的基因座短缺失。
CRISPR-Cas9系统强大的基因组编辑能力导致使用sgRNA文库来询问蛋白质编码基因以及非编码区域。通过sgRNA富集功能筛选，报告了几种用于蛋白质编码基因和/或有限数量的非编码基因的sgRNA文库，以鉴定调控特定细胞功能的基因和网络（Koike-Yusa等，2014; ...
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| A Ribosome Footprinting Protocol for Plants
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Date:
2016-11-05
[Abstract] Ribosome footprinting, or Ribo-seq, has revolutionized the studies of translation. It was originally developed for yeast and mammalian cells in culture (Ingolia et al., 2009). Herein, we describe a plant-optimized hands-on ribosome footprinting protocol derived from previously published procedures of polysome isolation (Ingolia et al., 2009; Mustroph et al., 2009) and ribosome footprinting (Ingolia et al., 2009; Ingolia et al., 2013). With this protocol, we have been able to successfully isolate and analyze high-quality ribosomal footprints from different stages of in vitro grown Arabidopsis thaliana plants (dark-grown seedlings [Merchante et al., 2015] and 13-day-old plantlets in plates and plants grown in liquid ...
[摘要] 核糖体足迹或Ribo-seq，彻底改变了翻译研究。它最初是为培养中的酵母和哺乳动物细胞开发的（Ingolia等人，2009）。本文中，我们描述了来自先前公开的多核糖体分离程序的植物优化的亲手核糖体印迹方案（Ingolia等人，2009; Mustroph等人，2009 ）和核糖体印迹（Ingolia等人，2009; Ingolia等人，2013）。使用该协议，我们能够成功地分离和分析来自体外生长的拟南芥植物（黑暗生长的幼苗）的不同阶段的高质量核糖体印迹[Merchante < ，以及在液体培养物中生长的板和植物中的13天龄小植物[未发表的结果]）。
[背景] 翻译在调节基因活性中的中心作用早已被公认，但是在响应于特定刺激的全基因组翻译定量变化的系统探索最近才变得技术上可行。最初为培养中的酵母和哺乳动物细胞开发的核糖体印迹技术（通常称为Ribo-seq）已经彻底改变了翻译调节和基因表达的研究，因为其允许确定核糖体在基因组 - ...
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| In vitro Assay for Cytidine Deaminase Activity of APOBEC3 Protein
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2014-10-20
[Abstract] Cytidine deaminases are enzymes that catalyze the removal of an amino group from cytidine, forming uridine. APOBEC3 (ApolipoproteinB mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide like) proteins are cytidine deaminases that deaminate cytidines in polynucleotides (RNA/DNA), resulting in editing of their target substrates. Mammalian APOBEC3 proteins are an important element in cellular defenses against retrovirus replication, and this “restriction” of retroviral infections is partially due to the cytidine deaminase activity of the APOBEC3.The present protocol (Nair et al., 2014) describes the assay to detect the deaminase activity of mouse APOBEC3 protein, which targets cytidines present in TCC or TTC motifs in a single-stranded DNA substrate. In brief, the protein preparation to be ...
[摘要] 胞苷脱氨酶是催化从胞苷去除氨基从而形成尿苷的酶。 APOBEC3（载脂蛋白B mRNA编辑酶，催化多肽样）蛋白质是在多核苷酸（RNA/DNA）中脱氨基胞苷的胞苷脱氨酶，导致其靶底物的编辑。哺乳动物APOBEC3蛋白是反转录病毒复制的细胞防御中的重要成分，并且这种逆转录病毒感染的"限制"部分是由于APOBEC3的胞苷脱氨酶活性。本方案（Nair等人， 2014）描述了检测小鼠APOBEC3蛋白的脱氨酶活性的测定法，其靶向存在于单链DNA底物中的TCC或TTC基序中的胞苷。简言之，将待测定的蛋白质制备物与含有脱氨靶基序的荧光团标记的寡脱氧核苷酸一起孵育（放射性标记的寡核苷酸底物也已被其他组成功使用）。寡核苷酸中的胞苷脱氨为尿苷;添加尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）催化尿嘧啶和糖之间的N-糖基键的水解，在寡核苷酸中产生无碱基（AB）位点。温碱处理在AB位点切割底物寡核苷酸;通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳从未切割的底物中分离切割的产物，并在荧光扫描仪上观察。
此处描述的协议主要根据Iwatani等人（2006）所描述的协议进行修改。当然，该测定可用于使用含有用于脱氨酶的含有胞苷的靶序列的寡核苷酸检测靶向DNA底物的其他APOBEC3脱氨酶的活性。
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