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Date:
2014-10-20
[Abstract] Cytidine deaminases are enzymes that catalyze the removal of an amino group from cytidine, forming uridine. APOBEC3 (ApolipoproteinB mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide like) proteins are cytidine deaminases that deaminate cytidines in polynucleotides (RNA/DNA), resulting in editing of their target substrates. Mammalian APOBEC3 proteins are an important element in cellular defenses against retrovirus replication, and this “restriction” of retroviral infections is partially due to the cytidine deaminase activity of the APOBEC3.The present protocol (Nair et al., 2014) describes the assay to detect the deaminase activity of mouse APOBEC3 protein, which targets cytidines present in TCC or TTC motifs in a single-stranded DNA substrate. In brief, the protein preparation to be ...
[摘要] 胞苷脱氨酶是催化从胞苷去除氨基从而形成尿苷的酶。 APOBEC3（载脂蛋白B mRNA编辑酶，催化多肽样）蛋白质是在多核苷酸（RNA/DNA）中脱氨基胞苷的胞苷脱氨酶，导致其靶底物的编辑。哺乳动物APOBEC3蛋白是反转录病毒复制的细胞防御中的重要成分，并且这种逆转录病毒感染的"限制"部分是由于APOBEC3的胞苷脱氨酶活性。本方案（Nair等人， 2014）描述了检测小鼠APOBEC3蛋白的脱氨酶活性的测定法，其靶向存在于单链DNA底物中的TCC或TTC基序中的胞苷。简言之，将待测定的蛋白质制备物与含有脱氨靶基序的荧光团标记的寡脱氧核苷酸一起孵育（放射性标记的寡核苷酸底物也已被其他组成功使用）。寡核苷酸中的胞苷脱氨为尿苷;添加尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）催化尿嘧啶和糖之间的N-糖基键的水解，在寡核苷酸中产生无碱基（AB）位点。温碱处理在AB位点切割底物寡核苷酸;通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳从未切割的底物中分离切割的产物，并在荧光扫描仪上观察。
此处描述的协议主要根据Iwatani等人（2006）所描述的协议进行修改。当然，该测定可用于使用含有用于脱氨酶的含有胞苷的靶序列的寡核苷酸检测靶向DNA底物的其他APOBEC3脱氨酶的活性。
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