| ChIP-seq Experiment and Data Analysis in the Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803
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Author:
Date:
2018-06-20
[Abstract] Nitrogen is an essential nutrient for all living organisms. In cyanobacteria, a group of oxygenic photosynthetic bacteria, nitrogen homeostasis is maintained by an intricate regulatory network around the transcription factor NtcA. Although mechanisms controlling NtcA activity appear to be well understood, the sets of genes under its control (i.e., its regulon) remain poorly defined. In this protocol, we describe the procedure for chromatin immunoprecipitation using NtcA antibodies, followed by DNA sequencing analysis (ChIP-seq) during early acclimation to nitrogen starvation in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 (hereafter Synechocystis). This protocol can be extended to analyze any DNA-binding protein in cyanobacteria for which suitable antibodies ...
[摘要] 氮是所有生物体的必需营养素。 在蓝细菌中，一组含氧光合细菌通过围绕转录因子NtcA的错综复杂的调节网络维持氮稳态。 尽管控制NtcA活性的机制似乎已被很好地理解，但其控制下的基因集（即它的调节子）仍然没有很好的定义。 在该协议中，我们描述了使用NtcA抗体进行染色质免疫沉淀的过程，随后在蓝藻Synechocystis sp。早期适应氮饥饿期间进行DNA测序分析（ChIP-seq）。 PCC 6803（以下简称<集气囊）。 该协议可以扩展到分析蓝细菌中存在合适抗体的任何DNA结合蛋白。
【背景】为了维持体内平衡，细菌经常需要响应环境变化来调整基因表达。许多这些调整是由转录因子（TF）控制的，这些转录因子可以感知代谢信号并激活或抑制目标基因。然而，反映传统上费力的任务来表征TFs在体内的活性和范围，我们对它们在细菌中的结合位点的了解仍然有限。直到最近，染色质免疫沉淀与高通量测序分析的结合为快速确定基因组水平调节子打开了大门。特别是，ChIP-seq使用下一代测序（NGS）的能力来并行识别大量DNA序列。与微阵列相比，ChIP-seq的一个有吸引力的特征是对某些区域如启动子序列没有限制，并且可以研究整个基因组的TF结合位点。
在蓝细菌中，氮同化和代谢的全球调节剂是NtcA，属于CRP（cAMP受体蛋白）家族的TF（Herrero等人，2001）。在集胞蓝细菌中，NtcA通过将二聚体结合至包含共有序列GTAN ...
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| Detecting the Interaction of Double-stranded RNA Binding Protein, Viral Protein and Primary miRNA Transcript by Co-immunoprecipitation in planta
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Author:
Date:
2018-05-05
[Abstract] MicroRNAs (miRNAs) play important roles in plant growth, development, and response to infection by microbes. Double-stranded RNA binding protein 1 (DRB1) facilitates the processing of primary miRNA transcripts into mature miRNAs. Recently, we found that NS3 protein encoded by rice stripe virus (RSV) associates with DRB1 and promotes miRNA biogenesis during RSV infection (Zheng et al., 2017). RNA co-immunoprecipitation (RIP) method was applied to identity association patterns among DRB1, NS3, and miRNA transcript.
[摘要] 微小RNA（miRNA）在植物生长，发育和微生物感染反应中发挥重要作用。 双链RNA结合蛋白1（DRB1）有助于将初级miRNA转录物加工成成熟的miRNA。 最近，我们发现水稻条纹病毒（RSV）编码的NS3蛋白与DRB1相关并促进RSV感染期间的miRNA生物合成（Zheng等人，2017）。 RNA共免疫沉淀（RIP）方法被用于鉴定DRB1，NS3和miRNA转录物之间的关联模式。
【背景】在双链RNA（dsRNA）结合蛋白HYPONASTIC LEAVES1（DRB1 / HYL1）的帮助下，通过RNA酶III酶DICER-LIKE1（DCL1）从其初级转录物（pri-miRNA） 锌指蛋白SERRATE（SE）。 水稻条纹病毒（RSV）感染广泛地干扰miRNA积累。 我们发现RSV编码的非结构蛋白3（NS3）通过与水稻中的DRB1相互作用下调pri-miRNAs来促进miRNA积累（Zheng等人，2017）。 为了揭示NS3如何增强pri-miRNA的加工，我们使用免疫共沉淀（Co-IP）来说明NS3，DRB1和pri-miRNA体内的关系。 该协议有助于了解两种蛋白质和一种RNA转录本之间的关联模式。
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| Histone Deubiquitination Assay in Nicotiana benthamiana
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Author:
Date:
2018-03-05
[Abstract] Histone modifications are a group of post-translational modifications on histones which can alter chromatin structure and affect gene expression. Histone ubiquitination is a histone modification found in particular on histone H2A and H2B. Histone ubiquitination can be reversed by ubiquitin-specific proteases (UBP). Here, we describe an in vivo assay for histone deubiquitination activity. After infiltrating UBP12 into Nicotiana benthamiana leaves, H2Aub was visualized by immunocytochemistry. Nicotiana benthamiana leaves, which show high agro infiltration efficiency, were used for transient UBP12 expression for a labor- and time-saving protocol. Reduced H2Aub levels indicated histone deubiquitination activity of UBP12. The clear visualization of nuclei of N. ...
[摘要] 组蛋白修饰是一组组蛋白翻译后修饰，可以改变染色质结构并影响基因表达。组蛋白泛素化是组蛋白H2A和H2B特异性发现的组蛋白修饰。泛素特异性蛋白酶（UBP）可以逆转组蛋白泛素化。在这里，我们描述了组蛋白去泛素化活性的体内试验。在将UBP12渗入烟草叶片中后，通过免疫细胞化学观察H2Aub。表现出高的农业渗透效率的本氏烟草叶用于瞬时UBP12表达，用于节省劳力和时间的方案。 H2Aub水平降低表明UBP12的组蛋白去泛素化活性。 N的核的清晰可视化。本生叶使得该方法能够通过使用特异性抗体容易地测量体内组蛋白修饰的水平，从而提供强大的蛋白质功能线索。因此，该协议是组蛋白去泛素化活性的体外试验的有力补充。
【背景】组蛋白修饰在调节染色质结构和基因表达中发挥重要作用。 研究最深入的组蛋白修饰包括甲基化，乙酰化，磷酸化，泛素化和sumoylation。 然而，引入或去除特定组蛋白修饰的酶并不总是已知的。 强大的体外试验可以确定组蛋白修饰酶的催化潜能，但是体内试验方法对于确认体外试验的特异性反映抗体的特异性是必要的。 体内活动。 在这里，我们描述了一个灵活的协议来测试植物组织中组蛋白修饰酶的活性。本塞姆氏。 尽管我们使用该方案来测试遍在蛋白特异性蛋白酶（UBP）对泛素化H2A的活性，但它也可以容易地用于其他特异性抗体可用的组蛋白修饰。
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