| DigiTAG–a RNA Sequencing Approach to Analyze Transcriptomes of Rare Cell Populations in Drosophila melanogaster
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Author:
Date:
2020-11-05
[Abstract] Cell-type specific transcriptional programs underlie the development and maintenance of organs. Not only distinct cell types within a tissue, even cells with supposedly identical cell fates show a high degree of transcriptional heterogeneity. Inevitable, low cell numbers are a major hurdle to study transcriptomes of pure cell populations. Here we describe DigiTAG, a high-throughput method that combines transposase fragmentation and molecular barcoding to retrieve high quality transcriptome data of rare cell types in Drosophila melanogaster. The protocol showcases how DigiTAG can be used to analyse the transcriptome of rare neural stem cells (type II neuroblasts) of Drosophila larval brains, but can also be utilized for other cell types or model systems.
[摘要] [摘要]细胞类型的特定转录程序是器官的发育和维持的基础。不仅组织内不同的细胞类型，甚至具有相同细胞命运的细胞也显示出高度的转录异质性。不可避免的是，低细胞数量是研究纯细胞群体转录组的主要障碍。在这里，我们介绍DigiTAG ，这是一种高通量方法，将转座酶片段化和分子条形码相结合，以检索果蝇中稀有细胞类型的高质量转录组数据。该协议展示了DigiTAG如何可用于分析果蝇幼虫的罕见神经干细胞（II型成神经细胞）的转录组 大脑，但也可以用于其他细胞类型或模型系统。
[背景]在发育过程中，不同细胞类型之间的过渡与组织稳态之间的关系是由大量转录因子及其诱导的转录变化所精心安排的。在过去的十年中，RNA测序（RNA- seq ）已成为测量整个基因组转录动力学的经典方法（Stark等，2019）。组织上的大量RNA序列不允许研究不同细胞群体的转录网络，特别是稀有细胞类型的转录网络。因此，需要提供低输入样品高质量转录组的RNA- seq方案。
在果蝇中，有限的材料通常构成分析特定组织或细胞类型的障碍。果蝇神经干细胞（称为神经母细胞）很好地说明了这一点（Homem和Knoblich ，2012）。存在成神经细胞的几个不同的亚群。例如，在果蝇的幼虫大脑中，只有16种II型成神经细胞产生神经元，神经元支配了运动和感觉处理所需的大脑区域（Walsh and ...
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| Analyzing (Re)Capping of mRNA Using Transcript Specific 5' End Sequencing
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Author:
Date:
2020-10-20
[Abstract] The 5′ cap is a ubiquitous feature of eukaryotic mRNAs. It is added in the nucleus onto newly synthesized pre-mRNA, and in the cytoplasm onto mRNAs after decapping or endonuclease cleavage. Cytoplasmic recapping can occur after loss of the cap at the native 5′ end, or downstream within the body of the mRNA. The identification and location of recapping events is key to understanding the functional consequences of this process. Here we present an approach that addresses this problem, using the Lexogen TeloPrime® cDNA synthesis kit to tag recapped 5′ ends. TeloPrime uses a proprietary DNA ligase to add a double stranded DNA oligonucleotide onto the 3′ end of cDNA while it is base paired with mRNA. Specificity for capped ends is obtained by the oligonucleotide having an unpaired C ...
[摘要] [摘要]5′cap是真核mRNAs普遍存在的特征。它被添加到新合成的pre-mRNA的细胞核中，并在去盖或核酸内切酶切割后加入到mRNAs的细胞质中。细胞质重拾可发生在5′端或mRNA体下游的cap缺失后。识别和定位重述事件是理解该过程的功能后果的关键。这里我们提出了一种解决这个问题的方法，使用Lexogen TeloPrime®cDNA合成试剂盒来标记重述的5′端。TeloPrime使用一种专有的DNA连接酶，在cDNA的3′端加入一个双链DNA寡核苷酸，同时与mRNA碱基配对。寡核苷酸在mRNA 5′端有一个与m7G弱碱基配对的不成对C残基。然后用引物对附加的寡核苷酸和感兴趣的mRNA进行双链cDNA的PCR扩增。得到的产物是凝胶纯化和直接测序（如果是单个带）或克隆和测序。连接的寡核苷酸和靶mRNA连接处的序列提供了cap在相应转录物上的位置。此方法适用于所有封顶转录本。它可以与Sanger测序一起用于少量的转录物，也可以用于Illumina库测序。
[背景]N7-甲基鸟苷帽是所有真核mRNAs的一个显著特征。与cap结合的蛋白质在mRNA生命周期的各个阶段发挥作用，包括核加工、输出、翻译和mRNA衰变。5′cap以共转录方式添加到所有mRNAs中，并开发了许多全基因组技术（例如，基因表达的Capped分析，或CAGE）（Morioka等人，2020年），这些技术利用末端末端的鉴定来标记转录起始位点。除了标记转录起始位点外，约25%的笼状标签映射到剪接内含子的下游（Djebali等人，2012年）。生物化学基础的证据来自我们实验室2009年的鉴定：一种细胞质复合体能够将N7甲基鸟苷帽恢复到5′-单磷酸末端的转录物上，但不能恢复到5′-羟基末端的转录物上（Otsuka等人，2009年）。细胞质封顶由一种复合酶催化，包括封盖酶（RNGTT）、帽甲基转移酶（RNMT）及其激活亚单位（RAM），以及一种将去盖转录物的5′-单磷酸末端转化为5′-二磷酸底物以进行GMP添加的激酶（Trotman和Schoenberg，2019）。我们的早期工作是基于在GMP添加步骤中阻断细胞质封盖的显性负型封盖酶的使用。该蛋白的表达导致出现许多未封顶的转录本，其末端使用5'-种族定位到下游笼状标签附近（Kiss等人，2015年；Berger等人，2019年）。虽然令人鼓舞，但这种方法有三个主要缺点：a）它需要分离带帽和未封顶的rna，b）它假设未封顶的转录本保持足够稳定，可以被检测到，以及c）它假设以这种方式检测到的未封顶末端经历了有限的额外的核外溶核修剪。 ...
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| Preparation of Sequencing RNA Libraries through Chemical Cross-linking Coupled to Affinity Purification (cCLAP) in Saccharomyces cerevisiae
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2018-10-05
[Abstract] Ribonucleoprotein particles (mRNPs) are complexes consisting of mRNAs and RNA-binding proteins (RBPs) which control mRNA transcription localization, turnover, and translation. Some mRNAs within the mRNPs have been shown to undergo degradation or storage. Those transcripts can lack general mRNA elements, like the poly(A) tail or 5’ cap structure, which prevent their identification through the application of widely-used approaches like oligo(dT) purification. Here, we describe a modified cross-linking affinity purification protocol (cCLAP) based on existing cross-linking and immunoprecipitation (CLIP) methods to isolate mRNAs which could be deadenylated, decapped and/or partially degraded in mRNPs, opening the possibility to detect different types of non-coding RNAs (ncRNAs). Once isolated, ...
[摘要] 核糖核蛋白颗粒（mRNP）是由mRNA和RNA结合蛋白（RBP）组成的复合物，其控制mRNA转录定位，转换和翻译。已显示mRNP内的一些mRNA经历降解或储存。那些转录物可能缺乏一般的mRNA元件，如poly（A）尾或5'帽结构，这通过应用广泛使用的方法如oligo（dT）纯化来阻止它们的鉴定。在这里，我们描述了基于现有的交联和免疫沉淀（CLIP）方法的修饰的交联亲和纯化方案（cCLAP），以分离mRNP中可被去腺苷酸化，去除和/或部分降解的mRNA，从而开启了检测不同的可能性。非编码RNA（ncRNA）的类型。分离后，将RNA进行衔接子连接，然后进行下一代测序（NGS）。由于快速有效的交联和淬灭步骤，该方案也适用于瞬时诱导的mRNP颗粒。实例包括由外在应激物触发的处理体（PB）或应力颗粒（SG）。其重现性和广泛应用使该方案成为研究特定RNP的RNA组成的有用且有力的工具。
【背景】mRNP内转录物的表征对于理解细胞转录和转录后过程至关重要。通过交联和免疫沉淀，然后通过RNA-Seq从mRNP颗粒中分离RNA已经成为鉴定mRNA靶标的常用方法（Tagwerker et al。，2006; Hafner et al。，2010; Kishore et al。，2011）。 ...
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