| Generation of Caenorhabditis elegans Transgenic Animals by DNA Microinjection
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Author:
Date:
2017-10-05
[Abstract] Microinjection is the most frequently used tool for genetic transformation of the nematode Caenorhabditis elegans, facilitating the transgenic expression of genes, genome editing by the clustered regularly interspersed short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 system, or transcription of dsRNA for RNA intereference (RNAi). Exogenous DNA is delivered into the developing oocytes in the germline of adult hermaphrodites, which then generate transgenic animals among their offspring. In this protocol, we describe the microinjection procedure and the subsequent selection of transgenic progeny.
[摘要] 显微注射是线虫秀丽隐杆线虫遗传转化中最常用的工具，促进基因的转基因表达，通过聚集的定期散布的短回文重复序列（CRISPR）-Cas9系统的基因组编辑或转录 dsRNA用于RNA干扰（RNAi）。 外源DNA被递送到成年雌雄同株的种系中的发育中的卵母细胞中，然后在它们的后代中产生转基因动物。 在该方案中，我们描述了显微注射程序和随后的转基因后代选择。
【背景】在C.通过显微注射的DNA转化通常用于产生过表达或异位表达可以与标签（例如，绿色荧光蛋白[GFP]）融合的基因的转基因动物，允许突变体的表型拯救和/或蛋白质的定位和功能的分析（Carter等人，1990; Chalfie等人，1994; Mello和Fire，1995）。聚集的定期散布的短回文重复（CRISPR）-Cas9系统的出现需要显微注射以通过引入点突变或插入/缺失突变来实现高度特异性的基因组编辑（概述于Dickinson和Goldstein，2016）。此外，该技术被应用于dsRNA的可诱导和/或组织特异性转录以便于遗传性RNA干扰（RNAi）（Tavernarakis等人，2000） ...
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| In vivo Mitophagy Monitoring in Caenorhabditis elegans to Determine Mitochondrial Homeostasis
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] Perturbation of mitochondrial function is a major hallmark of several pathological conditions and ageing, underlining the essential role of fine-tuned mitochondrial activity (Lopez-Otin et al., 2013). Mitochondrial selective autophagy, known as mitophagy, mediates the removal of dysfunctional and/or superfluous organelles, preserving cellular and organismal homeostasis (Palikaras and Tavernarakis, 2014; Pickrell and Youle, 2015; Scheibye-Knudsen et al., 2015). In this protocol, we describe a method for assessing mitophagy in the nematode Caenorhabditis elegans.
[摘要] 线粒体功能的扰动是几种病理状况和衰老的主要标志，强调了线粒体活性调控的重要作用（Lopez-Otin等，2013）。 线粒体选择性自噬，称为嗜中性细胞因子介导功能障碍和/或多余的细胞器的去除，保留细胞和有机体内稳态（Palikaras和Tavernarakis，2014; Pickrell和Youle，2015; Scheibye-Knudsen等，2015）。 在这个协议中，我们描述了一种评估线虫秀丽隐杆线虫线粒体的方法。
【背景】线粒体被认为是真核细胞的细胞动力，因为它们是通过氧化磷酸化（OXPHOS）和ATP生成的主要能量提供者。此外，它们在细胞稳态中的关键作用突出表现在它们对几种基本细胞过程（包括钙缓冲，代谢物合成和凋亡等）调节的贡献。线粒体功能的放松规律与几种病理状况（包括衰老和年龄相关的神经变性疾病）的发病有关（Vafai和Mootha，2012; Palikaras和Tavernarakis，2014）。因此，真核生物已经发展了几种复杂和高度专门化的分子途径来保护能量稳态（Pickrell和Youle，2015; Scheibye-Knudsen等，2015）。 Mitophagy是一种选择性类型的自噬，促进线粒体受损的消除，以及细胞调节线粒体内源物质和环境信号的主要降解途径（Palikaras等，2015; Schiavi et al。，2015; ...
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| Protein Synthesis Rate Assessment by Fluorescence Recovery after Photobleaching (FRAP)
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Author:
Date:
2017-03-05
[Abstract] Currently available biochemical methods cannot be applied to monitor protein synthesis in specific cells or tissues, in live specimens. Here, we describe a non-invasive method for monitoring protein synthesis in single cells or tissues with intrinsically different translation rates, in live Caenorhabditis elegans animals.
[摘要] 目前可用的生物化学方法不能用于监测活体标本中特定细胞或组织中的蛋白质合成。在这里，我们描述了在活的秀丽隐杆线虫动物中监测具有本质上不同的翻译速率的单个细胞或组织中的蛋白质合成的非侵入性方法。
背景 蛋白质合成的适当调节对于细胞稳态和生长至关重要。蛋白质合成的放松规律已经涉及到诸如癌症和衰老衰退的病理学（Bjornsti和Houghton，2004; Syntichaki等人，2007）。目前可用的用于测量一般蛋白质合成速率的生物化学方法包括代谢标记和多糖成像（Martin，1998; Rennie等人，1994）。这些方法的适用性受限于标签在整个动物或感兴趣组织中的摄取不足和不受控制或不平等的分布。此外，这些方法缺乏特异性，由于大部分样品的固有翻译速率的变异性，可能会掩盖特定细胞或感兴趣的组织的显着变化。在本协议中，我们描述了一种基于光漂白（FRAP）后的荧光恢复来监测线虫秀丽隐杆线虫的蛋白质合成速率的方法。实验方法是基于转基因动物感兴趣的细胞和组织中荧光蛋白的表达。然后通过用强大的光源照射细胞，组织或整个动物来对荧光进行光漂白。然后在感兴趣的细胞或组织中监测指示新蛋白质合成的荧光的恢复。
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