| Heterologous Expression and Purification of the CRISPR-Cas12a/Cpf1 Protein
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Author:
Date:
2018-05-05
[Abstract] This protocol provides step by step instructions (Figure 1) for heterologous expression of Francisella novicida Cas12a (previously known as Cpf1) in Escherichia coli. It additionally includes a protocol for high-purity purification and briefly describes how activity assays can be performed. These protocols can also be used for purification of other Cas12a homologs and the purified proteins can be used for subsequent genome editing experiments.
Figure 1. Timeline of activities for the heterologous expression and purification of Francisella novicida Cas12a (FnCas12a) from Escherichia coli
[摘要] 该协议提供了分步说明（图1），用于在大肠杆菌中异源表达新西兰弗朗西斯菌弗朗西丝菌Cas12a（以前称为Cpf1）。 它还包括一个高纯度纯化方案，并简要介绍如何进行活性测定。 这些方案也可以用于其他Cas12a同系物的纯化，并且纯化的蛋白质可以用于随后的基因组编辑实验。
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图1.从大肠杆菌 异源表达和纯化<弗朗西斯弗朗西丝菌 Cas12a（FnCas12a）的活动时间表
【背景】原核CRISPR-Cas免疫系统通过使用CRISPR RNA（crRNA）作为外源DNA或RNA的序列特异性靶向的指导来提供针对病毒和质粒的保护（van der Oost等人，2014; Marraffini ，2015）。 1类CRISPR-Cas系统（包含I型，III型和IV型）通常形成多亚基蛋白-cRNA效应复合物，而2类系统（包含II型，V型和VI型）依赖于单个crRNA-引导的效应物核酸酶用于目标干扰（Mohanraju et al。 2016年）。
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| Single-step Precision Genome Editing in Yeast Using CRISPR-Cas9
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] Genome modification in budding yeast has been extremely successful largely due to its highly efficient homology-directed DNA repair machinery. Several methods for modifying the yeast genome have previously been described, many of them involving at least two-steps: insertion of a selectable marker and substitution of that marker for the intended modification. Here, we describe a CRISPR-Cas9 mediated genome editing protocol for modifying any yeast gene of interest (either essential or nonessential) in a single-step transformation without any selectable marker. In this system, the Cas9 nuclease creates a double-stranded break at the locus of choice, which is typically lethal in yeast cells regardless of the essentiality of the targeted locus due to inefficient non-homologous end-joining ...
[摘要] 芽殖酵母中的基因组修饰已经非常成功，主要归功于其高度同源性的DNA修复机制。之前已经描述了几种用于修饰酵母基因组的方法，其中许多方法涉及至少两个步骤：插入选择标记并用该标记取代预期的修饰。在这里，我们描述了CRISPR-Cas9介导的基因组编辑方案，用于在没有任何选择标记的情况下在单步转化中修饰任何感兴趣的酵母基因（基本或非必需）。在该系统中，Cas9核酸酶在选择的基因座处产生双链断裂，这在酵母细胞中通常是致死的，而不管由于无效的非同源末端连接修复导致的靶基因座的重要性。该致死性通过使用源自PCR的修复模板的同源重组导致有效的修复。在涉及必需基因的情况下，用功能性等位基因编辑基因组病变的必要性作为额外的选择层。作为一个激励性的例子，我们描述了使用这种策略替代HEM2，一种必需的酵母基因，以及相应的人类直向同源物ALAD。
【背景】酿酒酵母（Baccharomyces cerevisiae，Baker's酵母）作为一种遗传易处理的生物体具有悠久的历史，并且有许多操作酵母基因组的方法。然而，直到最近，有必要应用选择以分离具有所需遗传改变的克隆（Kearse等人，2012; DiCarlo等人，2013; Lee等人，等，2015; ...
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| Isolation of Commensal Escherichia coli Strains from Feces of Healthy Laboratory Mice or Rats
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] The colonization abundance of commensal E. coli in the gastrointestinal tract of healthy laboratory mice and rats ranges from 104 to 106 CFU/g feces. Although very well characterized, the family that E. coli belongs to has a very homogeneous 16S rRNA gene sequence, making the identification from 16S rRNA sequencing difficult. This protocol provides a procedure of isolating and identifying commensal E. coli strains from a healthy laboratory mouse or rat feces. The method can be applied to isolate commensal E. coli from other laboratory rodent strains.
[摘要] 共生E的殖民丰度。 大肠杆菌在健康实验小鼠和大鼠的胃肠道中的范围为10 4至10 6 CFU / g粪便。 虽然描述得非常好，但那个家族就是这样的。 大肠杆菌属于具有非常均一的16S rRNA基因序列，使得从16S rRNA测序鉴定困难。 该协议提供了分离和识别共生E的程序。 来自健康实验室小鼠或大鼠粪便的大肠杆菌菌株。 该方法可以应用于隔离共生电子。 来自其他实验室啮齿类动物的大肠杆菌。
【背景】大肠杆菌是革兰氏阴性兼性厌氧菌，其仅构成脊椎动物肠道微生物群的一小部分，但在微生物相互作用，免疫调节和代谢功能中起关键作用（Tenaillon等人。，2010）。作为最好的模式微生物之一，共生E。已经越来越多地研究大肠杆菌菌株以揭示肠道共生微生物适应独特生态位并影响宿主生理机制。然而，不同菌株之间的高度同源性在共生E的鉴定和表征上提出了困难。基于16S rRNA测序方法的大肠杆菌。由于新一代测序技术的发展和全基因组的大规模分析，我们能够识别共生E。根据基因组中毒力基因的存在，分离自不同宿主的胃肠道的大肠杆菌菌株。在这个协议中，我们展示了一种分离和识别共生E的方法。使用选择性培养基和全基因组测序从实验室小鼠或大鼠获得大肠杆菌菌株。但是，应该指出的是，共生E的存在。大肠杆菌在实验室动物中取决于设施的供应商和环境条件。
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