| Colorimetric RT-LAMP and LAMP-sequencing for Detecting SARS-CoV-2 RNA in Clinical Samples
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Author:
Date:
2021-03-20
[Abstract] During pandemics, such as the one caused by SARS-CoV-2 coronavirus, simple methods to rapidly test large numbers of people are needed. As a faster and less resource-demanding alternative to detect viral RNA by conventional qPCR, we used reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). We previously established colorimetric RT-LAMP assays on both purified and unpurified SARS-CoV-2 clinical specimens and further developed a multiplexed sequencing protocol (LAMP-sequencing) to analyze the outcome of many RT-LAMP reactions at the same time (Dao Thi et al., 2020). Extending on this work, we hereby provide step-by-step protocols for both RT-LAMP assays and read-outs.
[摘要] [摘要]在大流行期间（例如由SARS-CoV-2冠状病毒引起的大流行），需要一种简单的方法来快速测试大量人员。作为通过常规qPCR检测病毒RNA的一种更快且资源更少的替代方法，我们使用了逆转录环介导的等温扩增（RT-LAMP）。我们先前在纯化和未纯化的SARS-CoV-2临床标本上建立了比色RT-LAMP分析方法，并进一步开发了多重测序方案（LAMP测序）来同时分析许多RT-LAMP反应的结果（Dao Thi等）等人，2020年）。在此工作的基础上，我们在此提供针对RT-LAMP分析和读数的分步操作规程。
[背景]新的SARS-CoV-2冠状病毒构成了重大的公共卫生问题（Li等人，2020年综述）。在缺乏有效的抗病毒治疗和保护性疫苗的情况下，通过大量检测防止局部暴发至关重要。检测SARS-CoV-2感染的标准诊断流程基于以下条件：从临床标本中分离病毒RNA，将RNA转录为cDNA的逆转录（RT）反应以及通过半定量DNA聚合酶链反应进行检测（qPCR）（Corman等，2020）。然而，商业化的RNA分离和RT-qPCR试剂盒价格昂贵，耗时且大流行期间供应短缺，从而限制了高通量测试，需要其他解决方案（Klein等人，2020）。
在我们最近的研究中（Dao ...
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| Primer ID Next-Generation Sequencing for the Analysis of a Broad Spectrum Antiviral Induced Transition Mutations and Errors Rates in a Coronavirus Genome
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Author:
Date:
2021-03-05
[Abstract] Next generations sequencing (NGS) has become an important tool in biomedical research. The Primer ID approach combined with the MiSeq platform overcomes the limitation of PCR errors and reveals the true sampling depth of population sequencing, making it an ideal tool to study mutagenic effects of potential broad-spectrum antivirals on RNA viruses. In this report we describe a protocol using Primer ID sequencing to study the mutations induced by antivirals in a coronavirus genome from an in vitro cell culture model and an in vivo mouse model. Viral RNA or total lung tissue RNA is tagged with Primer ID-containing cDNA primers during the initial reverse transcription step, followed by two rounds of PCR to amplify viral sequences and incorporate sequencing adaptors. Purified and pooled ...
[摘要] [摘要]下一代测序（NGS）已成为生物医学研究的重要工具。结合MiSeq平台的Primer ID方法克服了PCR错误的局限性，并揭示了群体测序的真实采样深度，使其成为研究潜在的广谱抗病毒剂对RNA病毒的诱变作用的理想工具。在本报告中，我们描述了一种使用引物ID测序的方案，用于研究体外细胞培养模型和体内小鼠模型中冠状病毒基因组中抗病毒药诱导的突变。在最初的反转录步骤中，病毒RNA或总肺组织RNA用含Primer ID的cDNA引物标记，然后进行两轮PCR扩增病毒序列并整合测序适配器。使用MiSeq平台对纯化和合并的文库进行测序。测序数据使用模板共有序列（TCS）网络应用处理。引物ID方法提供了一种精确的测序方案，可以测量病毒RNA基因组和宿主mRNA中的突变错误率。测序结果表明，β-D-N4-羟基胞嘧啶核苷（NHC）大大提高了病毒RNA基因组中的过渡取代率，但并未显着提高颠覆取代率，并且发现胞嘧啶（C）至尿苷（U）是最常见的突变。
[背景]下一代测序（NGS）已被广泛应用在生物医学研究中使用在过去十年。当应用NGS研究宿主内病毒种群的RNA病毒时，需要考虑对文库制备和测序方案的修改。样本之间的病毒滴度（或病毒载量）差异很大。传统的NGS平台在测序运行中需要1-500 ng的DNA（或RNA），但在大多数情况下，临床样品中的病毒RNA少于100 ...
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| Random Insertional Mutagenesis of a Serotype 2 Dengue Virus Clone
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Author:
Date:
2018-08-20
[Abstract] Protein tagging is a powerful method of investigating protein function. However, modifying positive-strand RNA virus proteins in the context of viral infection can be particularly difficult as their compact genomes and multifunctional proteins mean even small changes can inactivate or attenuate the virus. Although targeted approaches to functionally tag viral proteins have been successful, these approaches are time consuming and inefficient. A strategy that has been successfully applied to several RNA viruses is whole-genome transposon insertional mutagenesis. A library of viral genomes, each containing a single randomly placed small insertion, is selected by passaging in cell culture and the insertion sites can be identified using Next Generation Sequencing (NGS). Here we describe a ...
[摘要] 蛋白质标记是研究蛋白质功能的有效方法。然而，在病毒感染的情况下修饰正链RNA病毒蛋白可能特别困难，因为它们的紧密基因组和多功能蛋白意味着即使很小的变化也可以使病毒失活或减弱。尽管功能性标记病毒蛋白的靶向方法已经成功，但这些方法耗时且效率低。已经成功应用于几种RNA病毒的策略是全基因组转座子插入诱变。通过细胞培养中的传代选择病毒基因组文库，每个文库含有单个随机放置的小插入，并且可以使用下一代测序（NGS）鉴定插入位点。在这里，我们描述了用于登革病毒16681株血清型2的转座子诱变的方案。含有短随机放置插入物的突变登革病毒文库通过哺乳动物细胞传代，插入由有活力后代的NGS定位。该方案分为四个阶段：登革热cDNA克隆的转座子诱变，病毒基因组转染到允许细胞，分离病毒后代基因组和测序文库制备。
【背景】 ...
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