| Guanine Nucleotide Exchange Assay Using Fluorescent MANT-GDP
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] GTPases are molecular switches that cycle between the inactive GDP-bound state and the active GTP-bound state. GTPases exchange nucleotides either by its intrinsic nucleotide exchange or by interaction with guanine nucleotide exchange factors (GEFs). Monitoring the nucleotide exchange in vitro, together with reconstitution of direct interactions with regulatory proteins, provides key insights into how a GTPase is activated. In this protocol, we describe core methods to monitor nucleotide exchange using fluorescent N-Methylanthraniloyl (MANT)-guanine nucleotide.
[摘要] GTP酶是分子开关，在无效GDP结合状态和活性GTP结合状态之间循环。 GTP酶通过其内在的核苷酸交换或通过与鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）的相互作用来交换核苷酸。 监测体外核苷酸交换，以及与调节蛋白直接相互作用的重构，为GTP酶如何被激活提供了重要见解。 在该协议中，我们描述了使用荧光N-甲基呋喃酰基（MANT） - 鸟嘌呤核苷酸来监测核苷酸交换的核心方法。
【背景】GTPase是鸟嘌呤核苷酸结合蛋白，调节细胞过程的广度，从蛋白质生物合成到细胞周期进展，从细胞骨架重组到膜运输。 GTPases可以被认为是分子开关，它在GDP结合“关闭”状态和GTP结合“开启”状态之间循环;在通过GTP的GDP核苷酸交换结合GTP时，GTP酶变得活跃并且将结合下游效应蛋白以招募和激活这些效应子的生物学功能。 GTP酶通过与开关I环（G2结构域）的高度保守苏氨酸和开关II环（G3结构域）的DxxG基序内的甘氨酸的相互作用结合GTP的γ-磷酸。 GTP水解后，与γ-磷酸相互作用的丧失导致动态构象变化，从而使GTPase变为关闭状态（Vetter and ...
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| Expression and Purification of a Mammalian P2X7 Receptor from Sf9 Insect Cells
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Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] The P2X7 receptor is an extracellular ATP-gated ion channel found only in eukaryotes (Bartlett et al., 2014). Due to its unique properties among P2X receptors, such as formation of a large conductance pore, the P2X7 receptor has been implicated in devastating diseases like chronic pain (North and Jarvis, 2013). However, mechanisms underlying the P2X7 specific properties remain poorly understood, partly because purification of this eukaryotic membrane protein has been challenging. Here we describe a detailed protocol for expressing and purifying a mammalian P2X7 receptor using an insect cell-baculovirus system. The P2X7 receptor is expressed in Sf9 insect cells as a GFP fusion protein and solubilized with a buffer containing Triton X-100 detergent. The P2X7-GFP fusion protein is ...
[摘要] P2X7受体是仅在真核生物中发现的胞外ATP门控离子通道（Bartlett等，2014）。由于其P2X受体之间的独特性质，例如大电导孔的形成，P2X7受体已经涉及破坏性疾病如慢性疼痛（North和Jarvis，2013）。然而，P2X7特异性属性的机制仍然知之甚少，部分原因是纯化这种真核膜蛋白是一个挑战。在这里，我们描述了使用昆虫细胞 - 杆状病毒系统表达和纯化哺乳动物P2X7受体的详细方案。 P2X7受体在作为GFP融合蛋白的Sf9昆虫细胞中表达，并用含有Triton X-100洗涤剂的缓冲液溶解。然后使用Strep-Tactin亲和层析在含有十二烷基麦芽糖苷的缓冲液中纯化P2X7-GFP融合蛋白。在通过凝血酶酶切割连接的GFP和Strep-标签后，使用大小排阻色谱分离P2X7受体。该方法通常从6L的Sf9培养物产生约2mg的纯化蛋白质。纯化的蛋白质可以用含有15％甘油的缓冲液在4℃下储存至少2个月，并用于各种功能和结构研究（Karasawa和Kawate，2016）。
【背景】P2X7受体是嘌呤能P2X受体家族的七种亚型之一，并且是广泛疾病如神经退行性疾病，癫痫和神经性疼痛的有希望的新型药物靶点（North和Jarvis，2013; Bhattacharya和Biber， ...
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| Bacterial Survival in Dictyostelium
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Author:
Regin Rønn, Xiuli Hao, Freja Lüthje, Nadezhda A. German, Xuanji Li, Fuyi Huang, Javan Kisaka, David Huffman, Hend A. Alwathnani, Yong-Guan Zhu and Christopher Rensing,
Date:
2017-07-05
[Abstract] We performed an assay to test the ability of different E. coli strains to survive inside amoebal cells after ingestion. In the assay we incubated bacteria together with cells of Dictyostelium discoideum for six hours. After co-incubation most of the uningested bacteria were removed by centrifugation and the remaining uningested bacteria were killed by gentamicin. Gentamicin is used because it does not penetrate into eukaryotic cells allowing the ingested bacteria to survive the antibiotic treatment, whereas bacteria outside the amoebal cells are killed.
[摘要] 我们进行了一个测试来测试不同E的能力。 大肠杆菌菌株在摄入后在变形细胞内存活。 在测定中，我们将细菌与迪氏底盘藻细胞一起培养6小时。 共培养后，通过离心除去大部分未染色的细菌，剩余的未染色细菌被庆大霉素杀死。 使用庆大霉素，因为它不会渗透到真核细胞中，允许摄取的细菌在抗生素治疗中存活，而在变形细胞外的细菌被杀死。
【背景】细菌已经发展了几种不同的策略来避免或抵抗原生动物的捕食（Rønn等人，2012）。减少摄入机会，如增加细胞大小，聚集，生物膜形成和增加游泳速度的机制有充分的记录（Matz和Kjelleberg，2005;Rønn等人，2012），而机制允许细菌摄入后原生动物食物空泡中抵抗消化较少研究（龚等人，2016）。在这里，我们描述了一种方法来研究细菌菌株在通过社会变形虫的盘根盘菌摄入后存活的能力。我们使用这种测定法来研究铜是否耐药。大肠杆菌摄入后的生存机会比没有铜抗性的细菌更高（郝等，2016）。我们研究了铜电阻，因为已知巨噬细胞是在脊椎动物的免疫系统中具有重要作用的吞噬细胞，使用铜来杀死吞噬细胞中的细菌（Hodgkinson和Petris，2012）。我们假设这种杀伤机制最初是在多细胞生命发生之前自由生存的原生动物中发生的，因此铜抗性可能是保护细菌免受原生动物捕食的一个因素。
该测定法是用于评估巨噬细胞杀死细菌的能力的庆大霉素保护测定的修饰（参见例如，，Kaneko等人，2016），并且它利用庆大霉素不能渗入真核细胞。在原始测定中，在两个时间点确定巨噬细胞中的内化细菌细胞的数量。首先，将巨噬细胞与细菌一起培养给定的时间段，并且在这种共培养之后，去除未经检测的细菌并估计内化细菌的数量。巨噬细胞在没有细胞外细菌的情况下进行第二次测量，以使其消化内源性细菌。这两个估计之间的比率是细菌存活率的量度。 ...
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