| Stable Transformation of Arabidopsis thaliana Cell Suspension Cultures: A Case Study for the Overexpression of The COI1 Receptor
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Author:
Date:
2021-01-05
[Abstract] Cell suspension cultures have been studied for decades to produce natural molecules. However, the difficulty in generating stably transformed cell lines has limited their use to produce high value chemicals reproducibly and in elevated quantities.
In this protocol, a method to stably transform and maintain Arabidopsis cell suspension cultures is devised and presented in detail. Arabidopsis cell cultures were directly transformed with A. tumefaciens for the overexpression of the CORONATINE INSENSITIVE 1 (COI1) jasmonate receptor. Cell cultures were established after transformation and continuously maintained and tested for the overexpression of COI1. The protocol was also previously used to silence Arabidopsis peroxidases and allows for long ...
[摘要] [摘要]细胞悬浮培养已经研究了数十年，以生产天然分子。然而，产生稳定转化的细胞系的困难限制了它们用于可再现地和高产量地生产高价值化学品的用途。
在该协议中，设计并详细介绍了稳定转化和维持拟南芥细胞悬浮培养物的方法。直接用根癌农杆菌转化拟南芥细胞培养物，以过量表达可乐宁不敏感1（COI1）茉莉酸酯受体。转化后建立细胞培养物，并连续保持并测试COI1的过表达。该协议以前也曾用于沉默拟南芥过氧化物酶，并允许长期维持转化细胞。提供了在液体和固体培养基中培养维持的详细信息，以及蛋白质表达的证据来证实转化。
所描述的系统为合成生物学研究独立于发育控制的信号传递并获得生物技术和医学领域感兴趣的代谢物提供了强大的工具。
[背景]植物细胞悬浮培养为植物次生代谢产物的生产和去分化组织的研究提供了可行的替代方法（Wu和Ge，2004； Lee等，2010）。数十年来，人们对它们的使用兴趣不断提高，因为它们可以为人类使用的高价值生物技术产品提供连续生产系统。有各种各样的细胞培养物可产生大量具有商业和工业意义的次级代谢产物，例如花青素，甜菜碱，调味剂，甜菊苷等（Rao和Ravishankar，2002）。
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| Use of Optogenetic Amyloid-β to Monitor Protein Aggregation in Drosophila melanogaster, Danio rerio and Caenorhabditis elegans
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Author:
Date:
2020-12-05
[Abstract] Alzheimer’s Disease (AD) has long been associated with accumulation of extracellular amyloid plaques (Aβ) originating from the Amyloid Precursor Protein. Plaques have, however, been discovered in healthy individuals and not all AD brains show plaques, suggesting that extracellular Aβ aggregates may play a smaller role than anticipated. One limitation to studying Aβ peptide in vivo during disease progression is the inability to induce aggregation in a controlled manner. We developed an optogenetic method to induce Aβ aggregation and tested its biological influence in three model organisms–D. melanogaster, C. elegans and D. rerio. We generated a fluorescently labeled, optogenetic Aβ peptide that oligomerizes rapidly in vivo in the presence of blue light ...
[摘要] [摘要]Alzheimer'sdisease（AD）长期以来与淀粉样前体蛋白产生的细胞外淀粉样斑块（Aβ）的积聚有关。然而，在健康人身上发现了斑块，并不是所有的AD大脑都有斑块，这表明细胞外Aβ聚集体的作用可能比预期的要小。在疾病进展过程中研究Aβ肽的一个局限性是无法以可控的方式诱导聚集。我们开发了一种诱导Aβ聚集的光遗传学方法，并在三种模式生物中测试了其生物学效应：D.melanogaster、C.elegans和D.rerio。我们产生了一个荧光标记的，光生的
一种β肽，在所有生物体内，在蓝光存在下迅速寡聚。在这里，我们详细介绍了在动物模型中表达该融合蛋白的程序，使用延时光片显微镜研究对神经系统的影响，并进行代谢分析来测量由于细胞内Aβ聚集而引起的变化。这种方法利用光遗传学来研究AD的病理学，实现了目前任何其他方法都无法实现的体内时空控制。
[背景]阿尔茨海默病（AD）是一种衰弱的、与年龄相关的神经退行性疾病（Zhang等人，2011年；De ...
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| Confocal and Super-resolution Imaging of RNA in Live Bacteria Using a Fluorogenic Silicon Rhodamine-binding Aptamer
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Author:
Date:
2020-05-05
[Abstract] Genetically encoded light-up RNA aptamers have been shown to be promising tools for the visualization of RNAs in living cells, helping us to advance our understanding of the broad and complex life of RNA. Although a handful of light-up aptamers spanning the visible wavelength region have been developed, none of them have yet been reported to be compatible with advanced super-resolution techniques, mainly due to poor photophysical properties of their small-molecule fluorogens. Here, we describe a detailed protocol for fluorescence microscopy of mRNA in live bacteria using the recently reported fluorogenic silicon rhodamine binding aptamer (SiRA) featuring excellent photophysical properties. Notably, with SiRA, we demonstrated the first aptamer-based RNA visualization using super-resolution ...
[摘要] [摘要 ] 遗传编码的点亮适体是显示活细胞中RNA的有前途的工具，可帮助我们加深对RNA广泛而复杂的生命的理解。可见光波长区已经被开发，他们都没有然而，据报道，在兼容先进的超分辨率技术，主要是由于不良的光物理性质其小分子荧光团。在这里，我们描述了一个详细的协议对于荧光显微镜mRNA的使用最近报道的具有优异光物理性质的荧光罗丹明结合适体（SiRA ）在活细菌中进行检测。值得注意的是，我们利用SiRA 展示了首个使用超分辨率（STED）显微镜进行的基于适体的RNA可视化。这种成像方法可能特别有价值用于可视化原核生物中的RNA，因为细菌的大小仅比光学分辨率大几倍 传统显微镜的分辨率。
[背景 ] 可视化的具体RNA分子通过荧光显微镜具有不可估量的价值在过去二十年中扩大我们的知识RNA功能内的细胞在时空精气神（特亚吉，2009年;夏等人，2017年），由于缺乏。固有的荧光RNA，用于活细胞成像的荧光RNA标记工具的开发以及它们对最新显微镜的适应性 –特别是对于超分辨率显微镜– 势在必行。超分辨率显微镜（SRM）对于原核系统中的RNA成像特别有吸引力，因为细菌很小（〜2.5MYU中号长，0.5-1〜MYU 中号宽）和分辨率的标准荧光显微镜被限制在200〜300〜牛米，由于衍射极限光（Reshes ...
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