| Manganese Superoxide Dismutase Activity Assay in the Yeast Saccharomyces cerevisiae
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Author:
Date:
2020-03-05
[Abstract] Superoxide dismutases (SODs) act as a primary defence against reactive oxygen species (ROS) by converting superoxide anion radicals (O2-) into molecular oxygen (O2) and hydrogen peroxide (H2O2). Members of this enzyme family include CuZnSODs, MnSODs, FeSODs, and NiSODs, depending on the nature of the cofactor that is required for proper activity. Most eukaryotes, including yeast, possess CuZnSOD and MnSOD. This protocol aims at assessing the activity of the yeast Saccharomyces cerevisiae MnSOD Sod2p from cellular extracts using nitroblue tetrazolium staining. This method can be used to estimate the cellular bioavailability of Mn2+ as well as to evaluate the redox state of the cell.
[摘要] [摘要 ] 超氧化物歧化酶（SOD能）充当主防御针对反应性氧物质（ROS）通过转换的超氧阴离子自由基（O 2 - ）为分子氧（O 2 ）和过氧化氢（H 2 ? 2 ）。这种酶的家庭成员包括CuZnSODs ，MnSODs ，FeSODs 和NiSODs ，这取决于是需要适当的活动辅助因子的性质。大多数真核生物，包括酵母，都具有CuZnSOD 和MnSOD 。该协议旨在评估酵母的活性 使用硝基蓝四唑染色法从细胞提取物中提取酿酒酵母MnSOD Sod2p 。该方法可用于估计Mn 2+ 的细胞生物利用度以及评估细胞的氧化还原状态。
[背景 ] 的SODs被定义为减少正常有氧代谢为氧气和过氧化氢期间形成的氧的有害自由基含金属的抗氧化剂酶。：这些酶是基于需要作为辅因子进行适当的酶活性的金属分类CuZnSODs ，MnSODs ，FeSODs ，和NiSODs 。在酿酒酵母中，有两个S OD ：CuZn-Sod1p和Mn-Sod2p（Abreu和Cabelli ...
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| CRISPR-mediated Tagging with BirA Allows Proximity Labeling in Toxoplasma gondii
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] Defining protein interaction networks can provide key insights into how protein complexes govern complex biological problems. Here we define a method for proximity based labeling using permissive biotin ligase to define protein networks in the intracellular parasite Toxoplasma gondii. When combined with CRISPR/Cas9 based tagging, this method provides a robust approach to defining protein networks. This approach detects interaction within intact cells, it is applicable to both soluble and insoluble components, including large proteins complexes that interact with the cytoskeleton and unique microtubule organizing center that comprises the apical complex in apicomplexan parasites.
[摘要] 定义蛋白质相互作用网络可以为蛋白质复合物如何控制复杂的生物学问题提供关键信息 在这里我们定义了一种基于接近度的标记方法，使用宽容的生物素连接酶来定义细胞内寄生虫弓形虫的蛋白质网络。 当与基于CRISPR / Cas9的标记结合使用时，这种方法提供了一种可靠的方法来定义蛋白质网络。 这种方法检测完整细胞内的相互作用，它适用于可溶性和不可溶性成分，包括与细胞骨架相互作用的大型蛋白质复合物和独特的微管组织中心，其中包括顶尖复合体在顶尖复合寄生虫中。
【背景】分析蛋白质 - 蛋白质相互作用是解决蛋白质如何组装和作为大分子复合物的关键努力。传统上，通过免疫共沉淀（共-IP）和随后的质谱分析已经鉴定出蛋白质复合物。然而，一些蛋白质复合物取代基可能在co-IP的裂解，下拉和洗涤步骤期间人为失去或获得，这对于不溶性膜或需要侵蚀性溶解的结构蛋白质尤其成问题。作为co-IP的替代物，邻近依赖性生物素鉴定（BioID）提供了在正常细胞稳态期间紧邻目标靶蛋白的蛋白质“快照”（Roux等人，2012年）。 BioID利用融合到感兴趣的靶蛋白的混杂的大肠杆菌生物素蛋白连接酶（BirA）。生物素补充使得BirA融合物在30纳米内允许生物素化的近邻生物体（Roux et al。，2012; Van Itallie et al。，2013） ...
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| A Bioassay Protocol for Quorum Sensing Studies Using Vibrio campbellii
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Author:
Date:
2016-07-20
[Abstract] Quorum Sensing (QS), or bacterial cell-to-cell communication, is a finely-tuned mechanism that regulates gene expression on a population density-dependent manner through the production, secretion and reception of extracellular signaling molecules termed autoinducers (AIs). Given that QS plays an important role in bacterial biofilm formation and virulence factor production in many pathogenic strains, QS disruptors have become a hot topic in current antimicrobial research. There are several reporter strains exhibiting QS-regulated phenotypes that have been engineered for the identification of QS inhibitors, including, for example, pigment production (González and Keshavan, 2006; Steindler and Venturi, 2007), gfp, lacZ or lux reporter gene fusions (González and ...
[摘要] Quorum Sensing（QS）或细菌细胞与细胞间的通信是一种微调的机制，通过称为自体诱导物（AI）的细胞外信号分子的产生，分泌和接受，以群体密度依赖性方式调节基因表达。鉴于QS在许多致病菌株中的细菌生物膜形成和毒力因子产生中起重要作用，QS干扰物已经成为当前抗微生物研究的热门话题。存在几种报道菌株，其表现出QS-调节的表型，其已被工程化用于鉴定QS抑制剂，包括例如颜料产生（González和Keshavan，2006; Steindler和Venturi，2007），gfp < （gonzález和keshavan，2006;="" steindler和venturi，2007）或致死性基因融合下游qs控制的启动子（weiland-bräuer=""> et al 。，2015）。使用三个平行的QS电路，生物发光海洋细菌（Vibrio campbellii）（以前称为harveyi，Lin等人，2010）构成复杂的革兰氏阴性模型，存在广泛的知识，包括一系列突变生物传感器。在中。 campbellii ...
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