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Author:
Date:
2016-07-05
[Abstract] mRNA stability control is a critical step in the post-transcriptional regulation of gene expression. Actinomycin D, an antibiotic initially used as an anti-cancer drug, has turned out to be a convenient tool for studying the turnover rates of transcripts in cells, due to its inhibition of mRNA synthesis. Here, we describe a protocol for the measurement of mRNA decay after adding actinomycin D into the medium of stable fibroblast cell lines derived from wild-type and tristetraprolin (TTP)-deficient mouse embryonic fibroblast (MEF) cultures, as well as a protocol for determining the relative transcript abundance using semi-quantitative real-time RT-PCR. Northern blotting or NanoString n-Counter are alternative methods to measure mRNA abundance, which is quantified using a phosphorimager in ...
[摘要] mRNA稳定性控制是基因表达的转录后调控中的关键步骤。放线菌素D，一种最初用作抗癌药物的抗生素，由于其对mRNA合成的抑制，已经证明是用于研究细胞中转录物的转换率的方便的工具。在这里，我们描述了添加放线菌素D后的稳定成纤维细胞细胞系，从野生型和三四氯丙胺（TTP）缺陷小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）文化，以及一个协议使用半定量实时RT-PCR确定相对转录本丰度。 Northern印迹或NanoString n-Counter是测量mRNA丰度的备选方法，在前一种情况下使用phosphorimager对其进行定量。该方案适合于研究源自转基因小鼠及其各自对照的原代培养细胞和稳定细胞系，并且提供在具有和不具有目标基因的其他相同细胞中的mRNA衰减率的直接比较。
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Author:
Date:
2016-05-20
[Abstract] Respiratory syncytial virus (RSV) belongs to the paramyxovirus family that includes many clinically relevant viruses, such as the human metapneumovirus and measles. RSV infection can cause severe disease in infants, the elderly, and some immunocompromised adults. During RSV replication, a series of truncated forms of the viral genome is generated. These truncated viral genomes are known as defective viral genomes (DVGs) and are generated by many viruses (Lazzarini et al., 1981; Rao and Huang, 1982; Prince et al., 1996; Sun et al., 2015; Tapia et al., 2013). DVGs can restrict the replication of the full-length virus and are the primary natural triggers of the innate immune response to RSV (Sun et al., 2015; Tapia et al., 2013). ...
[摘要] 呼吸道合胞病毒（RSV）属于包括许多临床相关病毒（例如人偏肺病毒和麻疹）的副粘病毒家族。 RSV感染可以在婴儿，老年人和一些免疫受损的成人中引起严重的疾病。在RSV复制期间，产生一系列截短形式的病毒基因组。这些截短的病毒基因组被称为缺陷型病毒基因组（DVG），并且由许多病毒产生（Lazzarini等人，1981; Rao和Huang，1982; Prince等人， ，1996; Sun等人，2015; Tapia等人，2013）。 DVG可以限制全长病毒的复制，并且是针对RSV的先天免疫应答的主要天然触发因子（Sun等人，2015; Tapia等人 ，2013）。在这里，我们详细讨论如何准备具有高或低含量的DVG的RSV股票，以及如何从富含缺陷病毒颗粒的RSV原液中纯化含有DVG的缺陷病毒颗粒。这些程序可用于制备实验室研究所需的病毒原液和有缺陷的病毒颗粒。简言之，在HEp2细胞中产生不同的RSV种群，其通常用于在实验室中扩增该病毒。为了产生具有高含量DVG的RSV原液，HEp2细胞用高多重感染（MOI）多次感染，然后使用梯度离心纯化含有DVG的病毒颗粒。这里描述的方法具有四个部分：1.具有低DVG含量（RSV-LD）的种子RSV原种的扩增，2.具有高DVG含量（RSV-HD）的原种的产生，3.通过梯度离心，4.纯化DVG的表征。
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