| Generation of IgG-Fc Glycovariants Using Recombinant Glycosidases and Glycosyltransferases
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Author:
Date:
2016-08-05
[Abstract] The immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable (Fc) domain contains a single, highly conserved asparagine 297 (N297) glycosylation site in the CH2 domain, which is buried within the hydrophobic core of each of the two heavy chains. The biantennary core glycan structure, composed of 2 N-acetylglucosamine (GlcNAc) and 3 mannose residues, can be further decorated with fucose, bisecting GlcNAc and terminal GlcNAc, galactose, and sialic acid. Presence or absence of distinct residues can alter IgG effector functions such as antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) or complement-dependent cytotoxicity (CDC). Here, we provide a protocol for the generation of IgG-Fc de-galactosylated, galactosylated, de-sialylated and sialylated IgG antibodies using recombinant glycosidases and ...
[摘要] 免疫球蛋白G（IgG）片段可结晶（Fc）结构域在CH2结构域中包含单个，高度保守的天冬酰胺297（N297）糖基化位点，其掩埋在两条重链的每一条的疏水核内。由2个N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和3个甘露糖残基组成的双触角核心聚糖结构可以进一步用岩藻糖，二等分GlcNAc和末端GlcNAc，半乳糖和唾液酸装饰。不同残基的存在或不存在可以改变IgG效应子功能，例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）或补体依赖性细胞毒性（CDC）。在这里，我们提供使用重组糖苷酶和糖基转移酶产生IgG-Fc去半乳糖基化，半乳糖基化，去唾液酸化和唾液酸化IgG抗体的方案。
[背景] 糖基转移酶用于抗体聚糖修饰的用途允许将糖底物连接到预先存在的聚糖残基上。免疫球蛋白G在其每个CH2结构域中携带单个高度保守的N-糖基化位点（Arnold等人，2007）（图1），允许用糖基转移酶进行位点特异性聚糖修饰。如果抗体的Fab结构域含有Asn-X-Ser/Thr（X≠Pro）序列（Mellquist等人，1998），则抗体可携带额外的N-聚糖。因此，仔细选择缺少Fab糖基化的单克隆抗体对于Fc特异性聚糖修饰是重要的。本文所述的方案是基于以下出版物开发的（Kingston，2003; Kaneko等人，2006; Anthony等人，2008; Barb等人。，2009; Quast ...
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| Cloud-point PEG Glass Surfaces for Imaging of Immobilized Single Molecules by Total-internal-reflection Microscopy
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Author:
Date:
2016-04-05
[Abstract] This effective, robust protocol generates glass coverslips coated with biotin-functionalized polyethylene glycol (PEG), making the glass surface resistant to non-specific absorption of biomolecules, and permitting immobilization of biomolecules for subsequent single-molecule tracking of biochemical reactions. The protocol can be completed in one day, and the coverslips can be stored for at least 1 month. We have confirmed that the PEG surfaces prepared according to the protocol are resistant to non-specific adsorption by a wide range of biomolecules (bacterial, mitochondrial, and human transcription factors, DNA, and RNA) and biological buffers.
[摘要] 这种有效的，稳健的方案产生涂覆有生物素官能化聚乙二醇（PEG）的玻璃盖玻片，使得玻璃表面对生物分子的非特异性吸收具有抗性，并允许固定生物分子以用于随后的单分子跟踪生化反应。 协议可以在一天内完成，盖玻片可以存储至少1个月。 我们已经证实，根据方案制备的PEG表面可以通过广泛的生物分子（细菌，线粒体和人转录因子，DNA和RNA）和生物缓冲液的非特异性吸附抗性。
【背景】研究生物分子动力学的单分子成像方法通过允许实时跟踪多步反应而不需要同步试剂来补充传统的“大量”生物化学方法（Weiss，1999）。在大多数单分子成像方法中，首先用单个荧光团标记感兴趣的生物分子，然后将标记的生物分子固定在光学透明的表面（通常为玻璃或二氧化硅）上，并且被检测为衍射受限图像（“斑点”）使用配有高灵敏度相机的光学显微镜（Selvin和Ha，2008）。表面固定有两个目的。首先，它允许在超过几百毫秒的时间尺度上跟踪分子态（否则，生物分子将扩散到焦平面外）。第二，表面允许在全内反射几何中激发荧光（Axelrod，1981），其显着地增加了与表面接近（<100nm）位置的分子的检测的信噪比（selvin和哈，2008）。尽管有这些明显的优势，表面也是单分子分析中最常见的人为因素（visnapuu et=""> ...
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