| Preparation of Primary Cultures of Embryonic Rat Hippocampal and Cerebrocortical Neurons
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Author:
Date:
2017-09-20
[Abstract] This protocol aims at standardizing the procedure to obtain primary cultures of hippocampal and cerebrocortical neurons for in vitro experiments. Cultures should be prepared from cells isolated during embryonic development when neuronal precursor cells are not yet fully differentiated. This helps increasing the quality and quantity of cells, while offering minimal cell death that often occurs during dissociation of differentiated neurons. Cells plated under the appropriate conditions, either in Petri-dishes or in multi-well plates, will develop and establish synaptic contacts over time since the neuronal culture medium provides the nutrients and trophic factors required for differentiation. In this protocol we describe the methodology for the preparation of both cortical and ...
[摘要] 该方案旨在标准化海马和脑皮质神经元原代培养物的体外实验。 培养物应从胚胎发育期间分离的细胞制备，当神经元前体细胞尚未完全分化时。 这有助于提高细胞的质量和数量，同时提供通常在分化的神经元解离期间发生的最小的细胞死亡。 在合适的条件下，在培养皿或多孔板中铺板的细胞将随着时间的推移而发展和建立突触接触，因为神经元培养基提供分化所需的营养和营养因子。 在这个协议中，我们描述了制备皮质和海马神经元培养物的方法。
【背景】本方案描述了使用补充有NeuroCultTM SM1的Neurobasal培养基（Chen等人，2008）的大鼠海马和脑皮层神经元的原代培养物的制备。 NeuroCultTM SM1的组成基于B27补充剂的制剂（Brewer等，1993），但是前者的混合物被发现提高了神经元培养的质量，部分地通过用全转运蛋白替代载脂蛋白转运蛋白 Chen et al。，2008）。 此外，NeuroCultTM SM1的化学成分在原始出版物中有更详细的描述，可以更好地控制实验条件。 用化学确定的培养基制备的神经元培养物的特征在于存在低百分比的星形胶质细胞。 通过添加有丝分裂5-氟-2'-脱氧尿苷的化学抑制剂可以防止维持更长时间的培养物中星形胶质细胞的增殖以允许神经元分化。
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| Cloud-point PEG Glass Surfaces for Imaging of Immobilized Single Molecules by Total-internal-reflection Microscopy
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Author:
Date:
2016-04-05
[Abstract] This effective, robust protocol generates glass coverslips coated with biotin-functionalized polyethylene glycol (PEG), making the glass surface resistant to non-specific absorption of biomolecules, and permitting immobilization of biomolecules for subsequent single-molecule tracking of biochemical reactions. The protocol can be completed in one day, and the coverslips can be stored for at least 1 month. We have confirmed that the PEG surfaces prepared according to the protocol are resistant to non-specific adsorption by a wide range of biomolecules (bacterial, mitochondrial, and human transcription factors, DNA, and RNA) and biological buffers.
[摘要] 这种有效的，稳健的方案产生涂覆有生物素官能化聚乙二醇（PEG）的玻璃盖玻片，使得玻璃表面对生物分子的非特异性吸收具有抗性，并允许固定生物分子以用于随后的单分子跟踪生化反应。 协议可以在一天内完成，盖玻片可以存储至少1个月。 我们已经证实，根据方案制备的PEG表面可以通过广泛的生物分子（细菌，线粒体和人转录因子，DNA和RNA）和生物缓冲液的非特异性吸附抗性。
【背景】研究生物分子动力学的单分子成像方法通过允许实时跟踪多步反应而不需要同步试剂来补充传统的“大量”生物化学方法（Weiss，1999）。在大多数单分子成像方法中，首先用单个荧光团标记感兴趣的生物分子，然后将标记的生物分子固定在光学透明的表面（通常为玻璃或二氧化硅）上，并且被检测为衍射受限图像（“斑点”）使用配有高灵敏度相机的光学显微镜（Selvin和Ha，2008）。表面固定有两个目的。首先，它允许在超过几百毫秒的时间尺度上跟踪分子态（否则，生物分子将扩散到焦平面外）。第二，表面允许在全内反射几何中激发荧光（Axelrod，1981），其显着地增加了与表面接近（<100nm）位置的分子的检测的信噪比（selvin和哈，2008）。尽管有这些明显的优势，表面也是单分子分析中最常见的人为因素（visnapuu et=""> ...
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