| Tandem Purification of His6-3x FLAG Tagged Proteins for Mass Spectrometry from Arabidopsis
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Author:
Date:
2016-12-05
[Abstract] Tandem affinity purification is a powerful method to identify protein complexes that function in association with a known gene of interest. This protocol describes a methodology to capture proteins tagged with His6-3x FLAG explicitly for the purpose of on-bead digestion and identification by mass spectrometry. The high sensitivity and specificity of our methods allow for purification of proteins expressed at native levels from endogenous promoters to enable uncovering the functional roles of plant protein complexes.
[摘要] 串联亲和纯化是识别与已知感兴趣基因相关联的蛋白质复合物的有力方法。 该方案描述了一种用于捕获用His6-3x FLAG标记的蛋白质的方法，用于通过质谱法进行珠粒消化和鉴定。 我们的方法的高灵敏度和特异性允许从内源启动子纯化以天然水平表达的蛋白质，以揭示植物蛋白复合物的功能作用。
【背景】蛋白质复合物作为信号平台，分子机器和构建细胞生命的支架。鉴定蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）或蛋白质复合物的组成对于提供对基因生物化学功能的了解是非常重要的。因此，需要了解发现PPI的简便方法，以了解基因型如何决定植物中的表型。
通常使用的蛋白质纯化方法包括色谱法，例如大小排阻色谱法（也称为凝胶过滤），离子交换层析和亲和层析。通常需要组合几种不同的色谱方法以达到足够的纯度以鉴定相关的复合物。最近，亲和纯化与质谱联用（AP-MS）已经成为系统地鉴定体内蛋白质 - ...
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| Preparation and Analysis of Crude Autolytic Enzyme Extracts from Staphylococcus aureus
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Author:
Date:
2015-12-20
[Abstract] The metabolism of the cell surface during bacterial cell division involves synthesis and degradation of peptidoglycan (PGN), the major component of the bacterial cell wall. Bacteria have to ensure that their surface remains capable of withstanding high turgor pressures and, simultaneously, that the PGN at their surface is concealed from receptors produced by the host innate immune system. For cell separation to occur, and for PGN to be kept concealed, “old” PGN is degraded by specific PGN hydrolases, also known as autolysins, that are found at the bacterial cell surface or that are secreted into the growth medium.
Bacterial PGN hydrolases are cell wall lytic enzymes that comprise a broad and diverse group of proteins. It is often difficult to assign a specific function to a ...
[摘要] 细菌细胞分裂期间细胞表面的代谢涉及细菌细胞壁的主要组分肽聚糖（PGN）的合成和降解。细菌必须确保它们的表面能够承受高的膨胀压力，同时，它们表面的PGN被宿主先天免疫系统产生的受体所掩盖。为了发生细胞分离，并且对于PGN保持隐蔽，“老”PGN由在细菌细胞表面发现或分泌到生长培养基中的特定PGN水解酶（也称为自溶素）降解。
细菌PGN水解酶是包含广泛和多样化蛋白质组的细胞壁溶解酶。主要是因为生物体可以具有大量具有冗余活性的水解酶，并且一种水解酶可以具有多种酶活性并参与各种细胞过程（Vollmer等，2008），通常难以将特定功能分配给PGN水解酶。 。枯草芽孢杆菌35种已知或假设的PGN水解酶，而大肠杆菌（E.coli）和金黄色葡萄球菌（金黄色葡萄球菌）分别具有约16和19个PGN水解酶（Vollmer，2012; Heidrich等，2001; Singh et al。 ，2012）。
PGN水解酶可分为三大类：糖苷酶，酰胺酶和肽酶。糖苷酶切割聚糖主链，分为N-乙酰氨基葡糖苷酶和N-乙酰神经酰胺酶。酰胺酶切割肽链和聚糖链的N-乙酰神经酰胺残基之间的连接。肽酶，如内肽酶和羧肽酶能够切割PGN干肽的不同氨基酸之间的肽键。
在这里，我们描述了提取与金黄色葡萄球菌细胞壁非共价连接的PGN水解酶的方法（Vollmer，2008）。含有变性PGN水解酶的提取物的分析是通过运行Zymogram凝胶（含有粗细菌细胞壁或底物细胞的SDS-PAGE凝胶）进行的，然后将其在非变性缓冲液中温育以允许PGN水解酶复性。然后可以通过产生在细胞壁消化发生时观察到的清除条带来鉴定这些复性酶。方案分为三个步骤：A）从金黄色葡萄球菌细胞中制备粗自动提取物; ...
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| Purification of Rubisco from Chlamydomonas reinhardtii
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Author:
Date:
2015-12-05
[Abstract] Chlamydomonas reinhardtii is a model organism for chloroplast studies. Besides other convenient features, the feasibility of chloroplast genome transformation distinguishes this unicellular alga as ideal for the manipulation of chloroplastic gene expression aiming biotechnological goals, such as improved biofuel and biomass production. Ribulose 1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (EC 4.1.1.39, Rubisco) is the photosynthetic carbon-fixing enzyme which is considered crucial for biomass accumulation in algal cultures. Purification of wild type and site-directed mutants of Rubisco in C. reinhardtii is usually performed to study its catalytic properties and assess the carbon-fixing potential of the strains. In this protocol Rubisco is extracted through sonication of cell ...
[摘要] 衣藻衣原体是叶绿体研究的模式生物体。 除了其他方便的特点，叶绿体基因组转化的可行性区分这种单细胞藻理想的操纵叶绿体基因表达瞄准生物技术目标，如改善生物燃料和生物质生产。 核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（EC 4.1.1.39，Rubisco）是光合作用碳固定酶，其被认为对藻类培养物中的生物量累积是至关重要的。 Rubisco的野生型和定点突变体的纯化。 通常进行研究其催化性质并评估菌株的碳固定潜力。 在该方案中，通过细胞沉淀的超声处理提取Rubisco，并通过硫酸铵沉淀，蔗糖梯度离心（Goldwaithe和Bogorad，1975）和阴离子交换层析纯化。
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