| Analysis of Metals in Whole Cells, Thylakoids and Photosynthetic Protein Complexes in Synechocystis sp. PCC6803
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Date:
2018-06-20
[Abstract] Metals are essential in many biological processes, including oxygenic photosynthesis. Here we described a method to measure the metal pool in whole cells and thylakoids, including the bioactive pool in intact photosynthetic protein complexes in the model oxygenic cyanobacterium Synechocystis PCC6803. In the first part of the protocol, whole cells and thylakoid membranes are carefully prepared, in which the total metal concentrations are measured by inductively coupled plasma triple-quadrupole mass spectrometry (ICP-QQQ-MS). In the second part of the protocol, isolated thylakoids are solubilized to release the integral membrane proteins and the metal binding protein complexes. These intact photosynthetic protein complexes are subjected to size exclusion chromatography (SEC) and ...
[摘要] 金属在许多生物过程中是必不可少的，包括含氧光合作用。 在这里我们描述了测量全细胞和类囊体中金属库的方法，包括模型含氧蓝藻PCH6803中完整光合蛋白复合体中的生物活性库。 在方案的第一部分中，仔细制备全细胞和类囊体膜，其中通过电感耦合等离子体三重四极杆质谱（ICP-MS / MS）测量总金属浓度。 在该方案的第二部分，分离的类囊体被溶解以释放完整的膜蛋白和金属结合蛋白复合物。 将这些完整的光合蛋白复合物进行尺寸排阻色谱（SEC），并通过ICP-MS / MS进行连接分析尺寸分离的复合物中的金属结合。
【背景】氧光合作用的过程需要金属，因为它们在光合电子传递链中作为辅因子和催化剂的基本功能。光合装置需要Fe-S簇，血红素桥Fe和非血红素Fe形式的铁（Fe），可溶性移动电子载体蛋白质质体蓝素中的铜（Cu），叶绿素中的镁（Mg）， ...
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| ChIP-seq Experiment and Data Analysis in the Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803
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Date:
2018-06-20
[Abstract] Nitrogen is an essential nutrient for all living organisms. In cyanobacteria, a group of oxygenic photosynthetic bacteria, nitrogen homeostasis is maintained by an intricate regulatory network around the transcription factor NtcA. Although mechanisms controlling NtcA activity appear to be well understood, the sets of genes under its control (i.e., its regulon) remain poorly defined. In this protocol, we describe the procedure for chromatin immunoprecipitation using NtcA antibodies, followed by DNA sequencing analysis (ChIP-seq) during early acclimation to nitrogen starvation in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 (hereafter Synechocystis). This protocol can be extended to analyze any DNA-binding protein in cyanobacteria for which suitable antibodies ...
[摘要] 氮是所有生物体的必需营养素。 在蓝细菌中，一组含氧光合细菌通过围绕转录因子NtcA的错综复杂的调节网络维持氮稳态。 尽管控制NtcA活性的机制似乎已被很好地理解，但其控制下的基因集（即它的调节子）仍然没有很好的定义。 在该协议中，我们描述了使用NtcA抗体进行染色质免疫沉淀的过程，随后在蓝藻Synechocystis sp。早期适应氮饥饿期间进行DNA测序分析（ChIP-seq）。 PCC 6803（以下简称<集气囊）。 该协议可以扩展到分析蓝细菌中存在合适抗体的任何DNA结合蛋白。
【背景】为了维持体内平衡，细菌经常需要响应环境变化来调整基因表达。许多这些调整是由转录因子（TF）控制的，这些转录因子可以感知代谢信号并激活或抑制目标基因。然而，反映传统上费力的任务来表征TFs在体内的活性和范围，我们对它们在细菌中的结合位点的了解仍然有限。直到最近，染色质免疫沉淀与高通量测序分析的结合为快速确定基因组水平调节子打开了大门。特别是，ChIP-seq使用下一代测序（NGS）的能力来并行识别大量DNA序列。与微阵列相比，ChIP-seq的一个有吸引力的特征是对某些区域如启动子序列没有限制，并且可以研究整个基因组的TF结合位点。
在蓝细菌中，氮同化和代谢的全球调节剂是NtcA，属于CRP（cAMP受体蛋白）家族的TF（Herrero等人，2001）。在集胞蓝细菌中，NtcA通过将二聚体结合至包含共有序列GTAN ...
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| Lung Section Staining and Microscopy
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Author:
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2017-05-20
[Abstract] Our protocol describes immunofluorescent staining, hematoxylin and eosin staining and Masson’s trichrome staining on lung sections.
[摘要] 我们的方案描述了免疫荧光染色，苏木精和伊红染色以及Masson在肺切片上的三色染色。
背景 肺的主要功能是气体交换。肺由各种专门的细胞和组织组成，包括支气管，细支气管和肺泡，以促进气体交换。为了研究小鼠模型中的肺发育或肺部疾病，可以从小鼠中去除肺，并将其冷冻并嵌入最佳切割温度（OCT）化合物或化学保藏并包埋在石蜡中。为了保持肺组织结构，我们用1ml OCT化合物填充肺，用于制备冷冻切片，或用于石蜡切片的10％缓冲福尔马林（Zhou等人，2016）。然后将肺切片从冷冻或石蜡包埋的肺切片并安装到载玻片上用于制备染色。我们使用冷冻组织切片进行基于抗体的免疫荧光染色，并使用石蜡包埋切片进行苏木精和伊红（H＆E）染色或Masson三色染色。冷冻切片更快地准备免疫荧光染色，大多数抗体在冷冻切片上工作良好。石蜡切片也可用于免疫荧光染色，但需要脱蜡，补液和抗原检索。即使在抗原检索后，一些抗体在石蜡切片上也不能很好地工作。然而，石蜡样品可以在室温下储存很长时间，并且可以容易地切成非常薄的部分。石蜡切片保留比冷冻切片更好的组织形态，因此它们对于H＆E或三色染色更好。
＆NBSP;免疫荧光染色是一种使用荧光团观察特异性结合其靶蛋白的抗体位置的免疫组织化学。 ...
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