| Detection of Pathogens and Ampicillin-resistance Genes Using Multiplex Padlock Probes
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Author:
Date:
2017-08-20
[Abstract] Diagnostic assays for pathogen identification and characterization are limited either by the number of simultaneously detectable targets, which rely on multiplexing methods, or by time constraints due to cultivation-based techniques. We recently presented a 100-plex method for human pathogen characterization to identify 75 bacterial and fungal species as well as 33 clinically relevant β-lactamases (Barišić et al., 2016). By using 16S rRNA gene sequences as barcode elements in the padlock probes, and two different fluorescence channels for species and antibiotic resistance identification, we managed to cut the number of microarray probes needed by half. Consequently, we present here the protocol of an assay with a runtime of approx. 8 h and a detection limit of 105 cfu ...
[摘要] 用于病原体鉴定和表征的诊断测定法由依赖于多重方法的同时可检测目标的数量或由于基于培养的技术的时间限制来限制。 我们最近提出了一种用于人类病原体鉴定的100plex方法，以鉴定75种细菌和真菌物种以及33种临床相关β-内酰胺酶（Barišić等，2016）。 通过使用16S rRNA基因序列作为挂锁探针中的条形码元件，以及用于物种和抗生素抗性鉴定的两种不同的荧光通道，我们设法将需要的微阵列探针的数量减少一半。 因此，我们在这里介绍一个运行时间约为的测定方案。 8 h，检测限为105 cfu ml-1。 正确鉴定了89％的β-内酰胺酶和93.7％的物种。
【背景】β-内酰胺酶是一类提供抗β-内酰胺抗生素的抗生素抗性基因，其结构模拟D-丙氨酰-D-丙氨酸，细菌细胞壁的一个组分，从而抑制细菌细胞壁合成。 β-内酰胺酶能够水解β内酰胺抗生素β-内酰胺环的中心成分，并使其无效（Kong et al。，2010）。今天，描述了超过1000种β-内酰胺酶，并且存在巨大的潜在环境储层（Bush，2010; Brandt等，2017）。 ...
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| Robust Generation of Knock-in Cell Lines Using CRISPR-Cas9 and rAAV-assisted Repair Template Delivery
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Author:
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2017-04-05
[Abstract] The programmable Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-associated nuclease 9 (Cas9) technology revolutionized genome editing by providing an efficient way to cut the genome at a desired location (Ledford, 2015). In mammalian cells, DNA lesions trigger the error-prone non-homologous end joining (NHEJ) DNA repair mechanism. However, in presence of a DNA repair template, Homology-Directed Repair (HDR) can occur leading to precise repair of the lesion site. This last process can be exploited to enable precise knock-in changes by introducing the desired genomic alteration on the repair template. In this protocol we describe the delivery of long repair templates (> 200 nucleotides) using recombinant Adeno Associated Virus (rAAV) for CRISPR-Cas9-based knock-in of a ...
[摘要] 可编程集群定期间隔短回归度（CRISPR）相关核酸酶9（Cas9）技术通过提供在所需位置切割基因组的有效方式，彻底改变了基因组编辑（Ledford，2015）。 在哺乳动物细胞中，DNA损伤触发易发生非同源末端连接（NHEJ）DNA修复机制。 然而，在DNA修复模板的存在下，可以发生同源性定向修复（HDR），导致病变部位的精确修复。 可以利用最后的方法，通过在修复模板上引入所需的基因组改变来实现精确的敲入变化。 在本协议中，我们描述了使用重组腺相关病毒（rAAV）在人细胞系中进行基于CRISPR-Cas9的C-末端标签序列敲入的长修复模板（> 200个核苷酸）的递送。
尽管有关CRISPR-Cas9产生的敲门模型系统的大量报告，敲门砖报告仍然落后。由于许多应用，产生敲入细胞系仍然是基因组编辑的明显目标。敲入改变的引入通常依赖于修复模板DNA的存在，并且在位点特异性双链（ds）DNA断裂被引入接近改变位点的基因组中后，HDR修复机制的激活。不同的模板可以传送到修复机器，范围从含有广泛同源区域和可选选择盒的经典线性化载体到约200个核苷酸的单链（ss）DNA寡核苷酸（Chen等人， ...
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| Extraction and Measurement of Abscisic Acid in a Unicellular Red Alga Cyanidioschyzon merolae
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Author:
Date:
2016-12-05
[Abstract] Abscisic acid (ABA) has been known as a phytohormone of land plants, which is synthesized in response to abiotic stresses and induces various physiological responses, but is also found from eukaryotic algae. Recently, we reported that a unicellular red alga Cyanidioschyzon merolae produced ABA, which prevented cell growth and enhanced salt stress tolerance (Kobayashi et al., 2016). This report describes the detailed method for the extraction and quantification of ABA in the model red alga C. merolae.
[摘要] 脱落酸（ABA）已知为陆生植物的植物激素，其响应于非生物胁迫合成并诱导各种生理反应，但也可从真核藻类中发现。最近，我们报道了单细胞红藻（Cyanidioschyzon merolae）产生ABA，其阻止细胞生长和增强盐胁迫耐受性（Kobayashi等人，2016）。该报告描述了在红海藻模型中提取和定量ABA的详细方法。 。
关键字：脱落酸，藻类， Cyanidioschyzon merolae ，HPLC，植物激素
] 植物激素ABA已在发散光合真核生物中发现，但单细胞藻类的功能仍不清楚。在最近的研究中，我们显示单细胞红藻。 melorae 通过本方案累积ABA以应答盐胁迫。这是用于从C中提取和定量ABA的第一已公布方案的细节。 merolae 。此协议针对 C进行了优化。基于陆地植物协议的。
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