| Isolation of Nuclei in Tagged Cell Types (INTACT), RNA Extraction and Ribosomal RNA Degradation to Prepare Material for RNA-Seq
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] Gene expression is dynamically regulated on many levels, including chromatin accessibility and transcription. In order to study these nuclear regulatory events, we describe our method to purify nuclei with Isolation of Nuclei in TAgged Cell Types (INTACT). As nuclear RNA is low in polyadenylated transcripts and conventional pulldown methods would not capture non-polyadenylated pre-mRNA, we also present our method to remove ribosomal RNA from the total nuclear RNA in preparation for nuclear RNA-Seq.
[摘要] 基因表达在多个水平上动态调节，包括染色质可及性和转录。 为了研究这些核调节事件，我们描述了我们用净化细胞核（INTACT）纯化细胞核的方法。 由于核RNA在聚腺苷酸化转录物中低并且常规下拉方法不会捕获非聚腺苷酸化前mRNA，所以我们还提出了我们的方法以从核RNA总RNA中去除核糖体RNA以准备核RNA-Seq。
【背景】分离用于基因表达实验的特定细胞类型降低了噪音并提高了实验的精确度和发现的不同表达基因的数量。用于细胞类型特异性研究的各种方法被广泛使用，每种方法都有其优点和缺点（Bailey-Serres，2013年综述）。分离特定的调控区室，如细胞核（来自细胞器，核糖体，细胞质，等等）可以进一步精确解析调控基因表达的分子事件。在这里，我们描述了一种方法，可以从冷冻组织中分离特定细胞类型的细胞核，适用于研究核基因表达的实验（例如，核RNA的RNA-Seq，ATAC-Seq，ChIP -Seq，等。）。此外，我们描述了RNA的处理，导致材料适合作为RNA-Seq实验的输入。这里描述的方案与水稻根组织（日本野生稻栽培品种日本晴）（Reynoso等人，2018年）一起使用，但是它们基于以前开发的方案， （拟订和Henikoff，2010年和2011年）和番茄（罗恩等人，2014年）。
该协议的第一部分，INTACT方法（用于标记特定细胞类型的核的分离）允许体内亲和标记和随后从感兴趣的细胞类型中纯化细胞核。这是通过由包膜靶向结构域，GFP和生物素连接酶识别肽（BLRP）组成的三联核标签融合蛋白（NTF）的细胞类型特异性表达实现的。 ...
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| Tandem Purification of His6-3x FLAG Tagged Proteins for Mass Spectrometry from Arabidopsis
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Author:
Date:
2016-12-05
[Abstract] Tandem affinity purification is a powerful method to identify protein complexes that function in association with a known gene of interest. This protocol describes a methodology to capture proteins tagged with His6-3x FLAG explicitly for the purpose of on-bead digestion and identification by mass spectrometry. The high sensitivity and specificity of our methods allow for purification of proteins expressed at native levels from endogenous promoters to enable uncovering the functional roles of plant protein complexes.
[摘要] 串联亲和纯化是识别与已知感兴趣基因相关联的蛋白质复合物的有力方法。 该方案描述了一种用于捕获用His6-3x FLAG标记的蛋白质的方法，用于通过质谱法进行珠粒消化和鉴定。 我们的方法的高灵敏度和特异性允许从内源启动子纯化以天然水平表达的蛋白质，以揭示植物蛋白复合物的功能作用。
【背景】蛋白质复合物作为信号平台，分子机器和构建细胞生命的支架。鉴定蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）或蛋白质复合物的组成对于提供对基因生物化学功能的了解是非常重要的。因此，需要了解发现PPI的简便方法，以了解基因型如何决定植物中的表型。
通常使用的蛋白质纯化方法包括色谱法，例如大小排阻色谱法（也称为凝胶过滤），离子交换层析和亲和层析。通常需要组合几种不同的色谱方法以达到足够的纯度以鉴定相关的复合物。最近，亲和纯化与质谱联用（AP-MS）已经成为系统地鉴定体内蛋白质 - ...
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| Coupling of HIV-1 gp120-derived Core Protein to Paramagnetic Beads and Adsorption Assays
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Author:
Date:
2015-10-05
[Abstract] Analysis of the functional activity in polyclonal serum following immunization of a complex protein or glycoprotein immunogen is a very important but tedious process. Fine mapping of epitope-specific antibodies is difficult when they are elicited at relatively low levels. In our recent study focused on developing an HIV-1 vaccine, we immunized rabbits with hyperglycosylated stable core immunogens, which were designed using high-resolution structural information to elicit antibodies against the primary receptor-binding, CD4-binding site on HIV-1 gp120. Using a solid phase adsorption assay, we could map the serum antibodies to the conserved CD4-binding site, a known broadly neutralizing determinant on exterior envelope glycoprotein, gp120.
[摘要] 我们使用"微汤姆"来研究番茄果实成熟和发育机制。 "微汤姆"适合于培养和实验，由于其小尺寸10至20厘米的高度和短的生命周期3个月。 还有大量关于"Micro-Tom"的公开信息，包括EST，全长cDNA克隆和转录组数据。 "Micro-Tom"植物在水培培养基中在荧光下使用在温室或植物室中的拟南芥文化架来生长，以获得具有转录组和蛋白质组分析的可重复性的数据。...
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