| Detection of Pathogens and Ampicillin-resistance Genes Using Multiplex Padlock Probes
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Author:
Date:
2017-08-20
[Abstract] Diagnostic assays for pathogen identification and characterization are limited either by the number of simultaneously detectable targets, which rely on multiplexing methods, or by time constraints due to cultivation-based techniques. We recently presented a 100-plex method for human pathogen characterization to identify 75 bacterial and fungal species as well as 33 clinically relevant β-lactamases (Barišić et al., 2016). By using 16S rRNA gene sequences as barcode elements in the padlock probes, and two different fluorescence channels for species and antibiotic resistance identification, we managed to cut the number of microarray probes needed by half. Consequently, we present here the protocol of an assay with a runtime of approx. 8 h and a detection limit of 105 cfu ...
[摘要] 用于病原体鉴定和表征的诊断测定法由依赖于多重方法的同时可检测目标的数量或由于基于培养的技术的时间限制来限制。 我们最近提出了一种用于人类病原体鉴定的100plex方法，以鉴定75种细菌和真菌物种以及33种临床相关β-内酰胺酶（Barišić等，2016）。 通过使用16S rRNA基因序列作为挂锁探针中的条形码元件，以及用于物种和抗生素抗性鉴定的两种不同的荧光通道，我们设法将需要的微阵列探针的数量减少一半。 因此，我们在这里介绍一个运行时间约为的测定方案。 8 h，检测限为105 cfu ml-1。 正确鉴定了89％的β-内酰胺酶和93.7％的物种。
【背景】β-内酰胺酶是一类提供抗β-内酰胺抗生素的抗生素抗性基因，其结构模拟D-丙氨酰-D-丙氨酸，细菌细胞壁的一个组分，从而抑制细菌细胞壁合成。 β-内酰胺酶能够水解β内酰胺抗生素β-内酰胺环的中心成分，并使其无效（Kong et al。，2010）。今天，描述了超过1000种β-内酰胺酶，并且存在巨大的潜在环境储层（Bush，2010; Brandt等，2017）。 ...
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| Generation of Targeted Knockout Mutants in Arabidopsis thaliana Using CRISPR/Cas9
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Author:
Date:
2017-07-05
[Abstract] The CRISPR/Cas9 system has emerged as a powerful tool for gene editing in plants and beyond. We have developed a plant vector system for targeted Cas9-dependent mutagenesis of genes in up to two different target sites in Arabidopsis thaliana. This protocol describes a simple 1-week cloning procedure for a single T-DNA vector containing the genes for Cas9 and sgRNAs, as well as the detection of induced mutations in planta. The procedure can likely be adapted for other transformable plant species.
[摘要] CRISPR / Cas9系统已成为植物及其以外基因编辑的强大工具。 我们已经开发了植物载体系统，用于拟南芥中多达两个不同靶位点的基因的目标Cas9依赖性诱变。 该方案描述了对于含有Cas9和sgRNA的基因的单个T-DNA载体的简单的1周克隆程序，以及植物中诱导突变的检测。 该方法可能适用于其他可转化植物物种。
【背景】CRISPR / Cas9系统（Cas9）提供了一种简单且广泛适用的方法来修改感兴趣的基因组区域，因此成为植物和其他生物体基因组编辑的首选工具（Schiml和Puchta，2016）。该系统依赖于可以通过短的人造单指导RNA分子（sgRNA）向基因组DNA序列引导的化脓性链球菌（Cas9）的细菌Cas9核酸酶（Jinek等人， ，2012），在那里它创建一个双链断裂（DSB）。然后通过植物细胞的固有DNA修复机制修复这些DSB。在这里，可以区分两个主要途径（Salomon和Puchta，1998）。 （i）与DSB位点高度同源的DNA分子可用作修复模板。可以利用这种同源性定向修复（HDR）方法在DSB的现场引入特定的序列（Schiml等人，2014; Baltes and Voytas，2015）。然而，由于这些序列的低融合率，植物中HDR介导的基因编辑仍然具有挑战性。 ...
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| 3’ Rapid Amplification of cDNA Ends (3’ RACE) Using Arabidopsis Samples
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Author:
Date:
2015-10-05
[Abstract] Production of functional eukaryotic RNA is a very elaborate process that involves a complex interplay between transcription and various RNA processing activities, including splicing, 5’ capping, and 3’ cleavage and polyadenylation (Bentley, 2014). Accurate mapping of RNA ends provides a valuable tool to assess transcriptional and post-transcriptional events giving rise to different gene transcripts. The abundance of such transcripts most likely depends on exogenous and developmental cues, or mutations. In the reference plant Arabidopsis, perturbation of the HUA-PEP post-transcriptional regulatory factors (Rodríguez-Cazorla et al., 2015) leads to the accumulation of aberrant transcripts of the key floral homeotic gene AGAMOUS (AG) (Yanofsky et ...
[摘要] 功能真核RNA的生产是非常复杂的过程，其涉及转录和各种RNA加工活性（包括剪接，5'加帽和3'剪切和聚腺苷酸化）之间的复杂相互作用（Bentley，2014）。 RNA末端的精确作图提供了评估产生不同基因转录物的转录和转录后事件的有价值的工具。这种转录物的丰度最可能取决于外源和发育线索或突变。在参考植物拟南芥中，HUA-PEP 转录后调节因子（Rodríguez-Cazorla等人，2015）的扰动导致保留内含子序列的关键花卉同源异源基因（AGO）（ ）（Yanofsky等人，1990）的异常转录物的积累。通过3'RACE反应测定，这样的错误转录物对应于在AG 内含子区发生的过早加工和聚腺苷酸化事件。在这里我们描述了一个适用于分析相对丰富的转录物以及用于检测可能易于快速更新的异常RNA种类的方案。同样地，此处适于拟南芥生殖组织的方法可用于表征来自其他器官（叶，根）和/或其它植物物种的RNA种类。我们提供我们的3'RACE程序的详细方案，包括四个主要部分：总RNA提取，RNA量测定和质量控制，RACE程序本身，和分离所得RACE产物用于克隆和测序。
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