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Author:
Date:
2015-10-05
[Abstract] Production of functional eukaryotic RNA is a very elaborate process that involves a complex interplay between transcription and various RNA processing activities, including splicing, 5’ capping, and 3’ cleavage and polyadenylation (Bentley, 2014). Accurate mapping of RNA ends provides a valuable tool to assess transcriptional and post-transcriptional events giving rise to different gene transcripts. The abundance of such transcripts most likely depends on exogenous and developmental cues, or mutations. In the reference plant Arabidopsis, perturbation of the HUA-PEP post-transcriptional regulatory factors (Rodríguez-Cazorla et al., 2015) leads to the accumulation of aberrant transcripts of the key floral homeotic gene AGAMOUS (AG) (Yanofsky et ...
[摘要] 功能真核RNA的生产是非常复杂的过程，其涉及转录和各种RNA加工活性（包括剪接，5'加帽和3'剪切和聚腺苷酸化）之间的复杂相互作用（Bentley，2014）。 RNA末端的精确作图提供了评估产生不同基因转录物的转录和转录后事件的有价值的工具。这种转录物的丰度最可能取决于外源和发育线索或突变。在参考植物拟南芥中，HUA-PEP 转录后调节因子（Rodríguez-Cazorla等人，2015）的扰动导致保留内含子序列的关键花卉同源异源基因（AGO）（ ）（Yanofsky等人，1990）的异常转录物的积累。通过3'RACE反应测定，这样的错误转录物对应于在AG 内含子区发生的过早加工和聚腺苷酸化事件。在这里我们描述了一个适用于分析相对丰富的转录物以及用于检测可能易于快速更新的异常RNA种类的方案。同样地，此处适于拟南芥生殖组织的方法可用于表征来自其他器官（叶，根）和/或其它植物物种的RNA种类。我们提供我们的3'RACE程序的详细方案，包括四个主要部分：总RNA提取，RNA量测定和质量控制，RACE程序本身，和分离所得RACE产物用于克隆和测序。
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Author:
John Gray, Brett Burdo, Mary P. Goetting-Minesky, Bettina Wittler, Matthew Hunt, Tai Li, David Velliquette, Julie Thomas, Tina Agarwal, Kasey Key, Irene Gentzel, Michael dos Santos Brito, Maria Katherine Mejía-Guerra, Layne N. Connolly, Dalya Qaisi, Wei Li, Maria I. Casas, Andrea I. Doseff and Erich Grotewold,
Date:
2015-08-05
[Abstract] The construction of a physical collection of open reading frames (ORFeomes) for genes of any model organism is a useful tool for the exploration of gene function, gene regulation, and protein-protein interaction. Here we describe in detail a protocol that has been used to develop the first collection of transcription factor (TF) and co-regulator (CR) open reading frames (TFome) in maize (Burdo et al., 2014). This TFome is being used to establish the architecture of gene regulatory networks (GRNs) responsible for the control of transcription of all genes in an organism. The protocol outlined here describes how to proceed when only an incomplete genome with partial annotation is available. TFome clones are made in a recombination-ready vector of the Gateway? system, ...
[摘要] 任何模式生物的基因的开放阅读框（ORFeomes）的物理集合的构建是探索基因功能，基因调节和蛋白质 - 蛋白质相互作用的有用工具。在这里我们详细描述已经用于开发玉米中转录因子（TF）和共调节子（CR）开放阅读框（TFome）的第一集合的方案（Burdo等人， 2014）。该TFome用于建立基因调控网络（GRN）的架构，负责控制生物体中所有基因的转录。这里概述的协议描述如何进行时，只有一个不完整的基因组与部分注释可用。 TFome克隆在Gateway系统的重组准备好的载体中制备，允许ORF容易地转移到其它Gateway载体 - 例如那些合适的载体上用于在其他宿主物种中表达。虽然这个协议是为玉米TFome开发的，它可以很容易地应用于在其他真核物种中产生完整的ORFeome集合。
[Protocol overview] 成功的一个重要方面TFome代是用于建立可靠的一组基因模型的初始努力，使得它们随后可以被扩增或合成。用于特定物种的实际TFome构建方案将取决于可获得的资源，例如全长cDNA（flcDNA）收集和可靠的参考基因组（图1）。
在玉米的情况下，可获得flcDNA集合和基因组草图，但前者仅提供所需克隆的30％，后者含有缺口和一些错误的基因模型。为了开发用于玉米TF的接近完整的靶基因模型组，开发了如Yilmaz等人（2009）所述的生物信息学管道。简而言之，开发了一个双管齐下的搜索过程。第一个涉及在其他物种中制备TF的蛋白质序列的集合，并且可从数据库例如PlantTFDB，PlnTFDB和DBDTF获得。然后使用BLASTP将这些序列用于从玉米基因组草稿中搜索基因模型。第二个过程涉及开发定义TF家族并且在PFAM数据库中大多注释的域的集合（Finn等人，2014）。然后使用BLASTX将这些结构域用于搜索玉米基因组草图。存在的TF家族的数量及其命名可随着新成员被发现和研究而改变。表1提供了具有替代名称的已知TF家族的列表以及相应的PFAM域，其存在或不存在定义每个TF家族。可以从PFAM数据库（ ...
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