| Labelling HaloTag Fusion Proteins with HaloTag Ligand in Living Cells
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Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] HaloTag has been widely used to label proteins in vitro and in vivo (Los et al., 2008). In this protocol, we describe labelling HaloTag-Cbx fusion proteins by HaloTag ligands for live-cell single-molecule imaging (Zhen et al., 2016).
[摘要] HaloTag已广泛用于体外和体内标记蛋白质（Los et al。，2008）。 在本协议中，我们描述了通过HaloTag配体标记HaloTag-Cbx融合蛋白的活细胞单分子成像（Zhen等，2016）。
【背景】生物体的分子过程本质上是动态的。直接观察活细胞中的分子过程对于定量地了解生物系统的功能至关重要。荧光显微镜和荧光标记的最新进展使得能够可视化活细胞中单个单个分子的轨迹，提供有关动态相互作用和生物分子装配的见解（Kusumi等，2014; Liu等，2015; Tatavosian等， 2015; Cuvier和Fierz，2017）。用荧光团对生物分子进行特异性标记是荧光单分子成像的关键。 HaloTag是可以与活细胞中合成染料偶联的自标记标签蛋白（Los et al。，2008）。反应在活细胞中迅速发生，形成的共价键是特异性的和不可逆的。该技术已被用于研究体内遗传信息流，并测定活体哺乳动物细胞中基因调控的动力学（Liu et al。，2015; Zheng and Lavis，2017）。 Janelia FluorTM染料，如Janelia FluorTM ...
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| Exit from Pluripotency Assay of Mouse Embryonic Stem Cells
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Author:
Date:
2017-08-20
[Abstract] A novel method to assess the dissolution of the core pluripotency transcription-factor circuit of mouse Embryonic Stem Cells (mESCs) has been developed (Ying et al., 2003; Betschinger et al., 2013). In order to efficiently identify genes essential for the break-down of the pluripotency network in mutant mESCs with proliferation defects, we adapted this ‘exit from pluripotency assay’ (Bodak et al., 2017; Cirera-Salinas et al., 2017). The protocol described here has been successfully applied to several mESC lines and is easily transposable from one laboratory to another.
[摘要] 已经开发了评估小鼠胚胎干细胞（mESCs）的核心多能转录因子电路溶解的新方法（Ying等，2003; Betschinger等，2013）。 为了有效识别具有增殖缺陷的突变体mESCs中多能网络分解所必需的基因，我们调整了这种“多能性测定法”（Bodak等，2017; Cirera-Salinas等，2017）。 这里描述的方案已经成功应用于几个mESC系列，并且可以容易地从一个实验室转座到另一个实验室。
【背景】几十年来，科学家已经尝试确定基因与一般（例如胚胎体）或定向（例如，神经元前体细胞）分化方案的mESCs的分化潜能的机制。最近，发现2i培养基允许在体外俘获天真的干细胞（Ying et al。，2008）。 ...
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| An Optimized Method for the Production Using PEI, Titration and Neutralization of SARS-CoV Spike Luciferase Pseudotypes
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Author:
Date:
2017-08-20
[Abstract] The protocol outlined represents a cost-effective, rapid and reliable method for the generation of high-titre viral pseudotype particles with the wild-type SARS-CoV spike protein on a lentiviral vector core using the widely available transfection reagent PEI. This protocol is optimized for transfection in 6-well plates; however it can be readily scaled to different production volumes according to application. This protocol has multiple benefits including the use of readily available reagents, consistent, high pseudotype virus production Relative Luminescence Units (RLU) titres and rapid generation of novel coronavirus pseudotypes for research into strain variation, tropism and immunogenicity/sero-prevalence.
[摘要] 概述的方案代表了使用广泛可用的转染试剂PEI在慢病毒载体核心上产生具有野生型SARS-CoV刺突蛋白的高滴度病毒假型颗粒的成本效益，快速和可靠的方法。 该协议针对6孔板中的转染进行了优化; 然而，根据应用，它可以容易地扩展到不同的生产量。 该方案具有多种益处，包括使用容易获得的试剂，一致的，高假型病毒生产相对发光单位（RLU）滴度，并快速产生用于研究菌株变异，趋向性和免疫原性/血清流行性的新型冠状病毒假型。
【背景】假型病毒颗粒（PV）的生产和使用对于许多病毒是广泛建立的，并且在血清学，监测和疫苗开发领域的应用是多方面的（Temperton等人，2015; Carnell等人，2015）。 PV已经被证明是研究病毒包膜糖蛋白突变对血清学结果，病毒向性和免疫原性研究的影响的有力工具，特别是当与表位信息结合时。 PV是嵌合病毒构建体，其中一个病毒的外（表面）糖蛋白与另一病毒的复制缺陷病毒核心组合。 ...
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