| Lentiviral shRNA Screen to Identify Epithelial Integrity Regulating Genes in MCF10A 3D Culture
|
|
Author:
Date:
2016-12-05
[Abstract] MCF10A 3D culture system provides a reductionist model of glandular mammary epithelium which is widely used to study development of glandular architecture, the role of cell polarity and epithelial integrity in control of epithelial cell functions, and mechanisms of breast cancer. Here we describe how to use shRNA screening approach to identify critical cell pathways that couple epithelial structure to individual cell based responses such as cell cycle exit and apoptosis. These studies will help to interrogate genetic changes critical for early breast tumorigenesis. The protocol describes a library of lentiviral shRNA constructs designed to target epithelial integrity and a highly efficient method for lentiviral transduction of suspension MCF10A cultures. Furthermore, protocols are ...
[摘要] MCF10A 3D文化系统提供了腺体乳腺上皮的还原剂模型，其广泛用于研究腺体结构的发育，细胞极性和上皮完整性在上皮细胞功能的控制中的作用以及乳腺癌的机制。在这里我们描述如何使用shRNA筛选方法来识别关键细胞通路，夫妇上皮结构到个别细胞的反应，如细胞周期退出和凋亡。这些研究将有助于询问对早期乳腺肿瘤发生至关重要的遗传变化。该协议描述了设计用于靶向上皮完整性的慢病毒shRNA构建体的文库和用于悬浮MCF10A培养物的慢病毒转导的高效方法。此外，提供的协议设置MCF10A 3D文化在Matrigel的形态和细胞反应研究通过结构化照明和共聚焦显微镜分析免疫染色的三维结构。
关键字： 3D文化，MCF10A，shRNA，上皮完整性，免疫荧光染色，3D成像，形态测量分析
[背景] 上皮细胞形成高度组织的组织结构，其提供物理支持和用于协调细胞信号传导的结构化支架。跨上皮结构的这种协调的信号传导对于上皮生物学是基本的;使得上皮细胞在调节器官大小，形状，功能和基于个体细胞的应答中的动态联合作用（Roignot等人，2013; Shamir和Ewald，2014）。上皮信号传导的联合指挥还提供了一种强有力的肿瘤抑制机制，通过将外部和内部有丝分裂信号门控到静止的上皮组织（Partanen等人，2013; Rejon等人 ...
|
|
|
| Colon Cancer-associated Fibroblast Establishment and Culture Growth
|
|
Author:
Date:
2016-04-05
[Abstract] Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are one of the major players in tumor-stroma crosstalk. Findings in experimental studies suggest important roles for CAFs in regulation of tumor growth, metastasis and drug response (Hanahan and Coussens, 2012). Furthermore, their clinical relevance is supported by new findings from tumor analyses, demonstrating the prognostic and response-predictive significance of CAF-derived markers or gene signatures (Berdiel-hacer et al., 2014; Finak et al., 2008; Navab et al., 2011; Paulsson and Micke, 2014). CAFs are a heterogeneous pool of cell subsets with distinct functions which needs to be better defined by their marker expressions. The development of a methodology for the establishment of fibroblast primary cultures derived from ...
[摘要] 癌症相关成纤维细胞（CAF）是肿瘤 - 基质串扰的主要参与者之一。实验研究的结果表明CAFs在肿瘤生长，转移和药物反应的调节中的重要作用（Hanahan和Coussens，2012）。此外，它们的临床相关性得到来自肿瘤分析的新发现的支持，表明CAF衍生的标记或基因特征的预后和应答预测显着性（Berdiel-hacer等人，2014; Finak 等人，2008; Navab等人，2011; Paulsson和Micke，2014）。 CAF是具有不同功能的细胞亚群的异质池，其需要由它们的标记表达更好地定义。开发用于建立源自人结肠肿瘤的成纤维细胞原代培养物的方法允许我们表征其功能和分子性质（Herrera等人，2013）。此外，CAF影响肿瘤生长和转移的不同分子机制仍有待澄清。因此，癌症相关成纤维细胞的功能和分子表征是完全了解他们在肿瘤进展中的作用的必要条件。
|
|
|
| Isolation of Particles of Recombinant ASC and NLRP3
|
|
Author:
Date:
2015-05-20
[Abstract] NLRP3 inflammasome is a multiprotein complex responsible for the activation of inflammatory caspase-1, resulting in processing and release of pro-inflammatory cytoquines IL-1β and IL-18 (Schroder and Tschopp, 2010). This inflammasome is composed of the sensor protein NLRP3 connected to caspase-1 through the adaptor protein ASC (apoptosis-associated speck-like protein with a caspase-recruitment domain) (Schroder and Tschopp, 2010). We and others have reported that upon inflammasome activation functional oligomeric inflammasome particles of NLRP3 and ASC were released from cells, acting as danger signals to amplify inflammation by promoting the activation of caspase-1 extracellularly (Baroja-Mazo et al., 2014; Franklin et al., 2014).
Studying the extracellular ...
[摘要] NLRP3炎症小体是负责炎症半胱天冬酶-1活化的多蛋白复合物，导致促炎细胞因子IL-1β和IL-18的加工和释放（Schroder和Tschopp，2010）。这种炎症小体由通过衔接蛋白ASC（凋亡相关的斑点样蛋白与半胱氨酸蛋白酶募集结构域）连接到caspase-1的传感蛋白NLRP3组成（Schroder和Tschopp，2010）。我们和其他人已经报道，在炎症小体激活时，NLRP3和ASC的功能性寡聚炎症小体颗粒从细胞中释放，充当危险信号，通过促进细胞外caspase-1的活化来扩增炎症（Baroja-Mazo等，
通过纯化ASC的重组颗粒或组成型激活的NLRP3突变体来研究寡聚ASC和NLRP3炎症小体颗粒的细胞外功能是可能的与相关的cryopyrin相关周期性综合征（CAPS，突变p.D303N），都标记有黄色荧光蛋白（YFP），并在HEK293细胞中表达。通过重组ASC或突变体NLRP3在HEK293细胞中的表达导致它们自发聚集成斑点（Baroja-Mazo等人，2014）的事实促进了纯化过程，并且方案最初从Fernandes-Alnemri和Alnemri（2008年）。
|
|
|