| Preparation of Bacterial Outer Membrane Vesicles for Characterisation of Periplasmic Proteins in Their Native Environment
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Author:
Date:
2020-12-20
[Abstract] Bacterial outer membrane vesicles (OMVs) are naturally formed by budding from the outer membrane of Gram-negative bacteria. OMVs consist of a lipid bilayer identical in composition to the original outer membrane and contain periplasmic content within their lumen. Enriched with specific envelope proteins, OMVs make for an excellent native-like platform to study these proteins in-situ using biophysical methods. Here, we describe in detail the preparation of OMVs from Escherichia coli, which are luminally enriched with periplasmic proteins and uniformly labeled with stable isotopes (2H and 15N), suitable for the subsequent characterisation of proteins at atomic resolution in their native environment by solution-state NMR spectroscopy. The ability to perform structural studies of periplasmic ...
[摘要] [摘要]细菌外膜囊泡（OMV）是由革兰氏阴性细菌的外膜出芽自然形成的。OMV由组成与原始外膜相同的脂质双层组成，并且在其内腔中含有周质成分。OMV富含特定的包膜蛋白，是使用生物物理方法原位研究这些蛋白的绝佳天然样平台。在这里，我们详细描述了从大肠杆菌制备OMV的方法，该方法在光亮时富含周质蛋白，并用稳定的同位素（2 H和15 N）均匀标记，适用于后续表征溶液状态NMR光谱分析天然环境中蛋白质的原子分辨率。执行周质成分的结构研究的能力，现场清除的方式来REAC兴的这种独特的细胞室的功能和机理细节的深入了解。
[背景]革兰氏阴性菌的周质是一个相当了不起的细胞室。这个空间中，内和外细菌膜之间禁闭，包含在抽蛋白一个ö ř dinarily高浓度超过300毫克毫升-1 （奥利弗，1996） ，并且在不存在的细胞来源，如ATP，功能几乎大力独立从其胞质对应物。到目前为止，有关周质蛋白的结构知识是使用从其天然环境分离的纯化蛋白专门获得的。因此，这种特殊环境可能对蛋白质施加的任何结构和功能影响在纯化过程中都会丢失。由于周质的体积比低，阻碍了使用生物物理方法如细胞内NMR光谱原位研究周质蛋白的努力，周质的体积比仅占细菌总体积的5-1 0％（Brass等，1986）。 ）。
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| Advances in Proximity Ligation in situ Hybridization (PLISH)
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Author:
Date:
2020-11-05
[Abstract] Understanding tissues in the context of development, maintenance and disease requires determining the molecular profiles of individual cells within their native in vivo spatial context. We developed a Proximity Ligation in situ Hybridization technology (PLISH) that enables quantitative measurement of single cell gene expression in intact tissues, which we have now updated. By recording spatial information for every profiled cell, PLISH enables retrospective mapping of distinct cell classes and inference of their in vivo interactions. PLISH has high sensitivity, specificity and signal to noise ratio. It is also rapid, scalable, and does not require expertise in molecular biology so it can be easily adopted by basic and clinical researchers.
[摘要] [摘要]在发育，维持和疾病的背景下了解组织需要确定单个细胞在其天然体内空间范围内的分子谱。我们开发了一种邻近连接原位杂交技术（PLISH），该技术能够定量测量完整组织中单细胞基因的表达，现已更新。通过记录每个分析细胞的空间信息，PLISH可以回顾性绘制不同细胞类别并推断其体内 互动。PLISH具有很高的灵敏度，特异性和信噪比。它也快速，可扩展，并且不需要分子生物学方面的专门知识，因此基础和临床研究人员可以轻松地采用它。
[背景技术]我们最近开发了一种复用原位称为PLISH（邻位连接杂交技术原位杂交）（Nagendran等人，2018）。PLISH与其他现有的空间转录组学技术不同，因为它结合了高性能，快速多路复用，低成本和技术简单性（Wilbrey -Clark等人，2020年）。可以通过自动计算完整的冷冻或石蜡包埋组织中单细胞表达图谱来分析PLISH结果，它与同时进行的免疫染色兼容。
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| Identification of Socially-activated Neurons
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Author:
Date:
2020-09-05
[Abstract] Determining the neuronal circuitry responsible for specific behaviors is a major focus in the field of neurobiology. Activity-dependent immediate early genes (IEGs), transcribed and translated shortly after neurons discharge action potentials, have been used extensively to either identify or gain genetic access to neurons and brain regions involved in such behaviors. By using immunohistochemistry for the protein product of the IEG c-Fos combined with retrograde labeling of specific neuronal populations, precise experimental timing, and identical data acquisition and processing, we present a method to quantitatively identify specific neuronal subpopulations that were active during social encounters. We have previously used this method to show a stronger recruitment of ventral hippocampal ...
[摘要] [摘要] 确定负责特定行为的神经元回路是神经生物学领域的主要重点。在神经元释放动作电位后不久就转录和翻译的依赖活动的立即早期基因（IEG）已被广泛用于识别或获得涉及此类行为的神经元和大脑区域的遗传途径。通过对IEG c- Fos 的蛋白质产物使用免疫组织化学，结合特定神经元群体的逆向标记，精确的实验时间，相同的数据采集和处理 ng，我们提出了一种方法，可以定量地识别在社交活动中活跃的特定神经元亚群。与社交活动后投射到下丘脑外侧的神经海马神经元相比，我们以前曾使用这种方法显示出投射到内侧前额叶皮层的腹侧海马神经元更强的募集。在优化用于逆行示踪剂注射的手术后，该方法将有助于识别和定位参与许多不同行为的神经元群体。
[背景] 神经生物学领域的基本目标是确定大脑如何处理感觉输入并产生行为输出命令。在过去的二十年中，某些大脑区域已成为控制特定行为的典范实例，例如海马体用于位置记忆（Bird和Burgess，2008年）。最近的工作开始以可以推广到多种行为的方式来解析这些区域的特定功能（Aronov 等人，2017），并确定在由远程神经元连接的给定行为中多个大脑区域的作用投影（ ...
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