| A Method for User-defined Mutagenesis by Integrating Oligo Pool Synthesis Technology with Nicking Mutagenesis
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Author:
Date:
2020-08-05
[Abstract] Saturation mutagenesis is a fundamental enabling technology for protein engineering and epitope mapping. Nicking mutagenesis (NM) allows the user to rapidly construct libraries of all possible single mutations in a target protein sequence from plasmid DNA in a one-pot procedure. Briefly, one strand of the plasmid DNA is degraded using a nicking restriction endonuclease and exonuclease treatment. Mutagenic primers encoding the desired mutations are annealed to the resulting circular single-stranded DNA, extended with high-fidelity polymerase, and ligated into covalently closed circular DNA by Taq DNA ligase. The heteroduplex DNA is resolved by selective degradation of the template strand. The complementary strand is synthesized and ligated, resulting in a library of mutated ...
[摘要] [摘要] 饱和突变是蛋白质工程和表位定位的基础技术。缺口突变（NM）允许用户在一锅程序中快速构建目标蛋白序列中所有可能的单一突变的文库。简言之，质粒DNA的一条链被切痕限制性内切酶和核酸外切酶处理降解。编码所需突变的突变引物退火成环状单链DNA，用高保真聚合酶延伸，并通过taqdna连接酶连接成共价闭合的环状DNA。通过选择性降解模板链来分解异源双链DNA。合成并连接互补链，形成一个共价闭合的环状质粒库。后来的研究表明，由于该过程中使用的引物很少，因此通常在使用前需要扩增的再悬浮寡聚物池可以直接用于诱变过程。因为寡聚体可以包含数以万计的独特寡聚体，这使得在一个单罐突变反应中能够构建数以万计用户定义突变的库，这显著提高了NM的效用，如下所述。
寡聚物的使用为诱变实验提供了一种经济上有利的方法。首先，寡核苷酸池合成比传统合成便宜得多。第二，可以产生一个混合池，用于多个不同基因的诱变。为了使用同一个寡聚体进行多种基因的诱变，使用者只需量化特定于其诱变实验的寡聚体部分，并调整寡聚体的体积和有效浓度，以用于缺口突变。
[背景] 蛋白质功能序列相关性的评价对于蛋白质科学的应用和基础研究具有重要意义。近年来，深度突变扫描（DMS）已经上升到基于蛋白质的研究的前沿（Fowler and ...
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| Characterization of Protein Domain Function via in vitro DNA Shuffling
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Author:
Date:
2018-06-05
[Abstract] We recently investigated the molecular events that drive evolution of the CTX-M-type β-lactamases by DNA shuffling of fragments of the blaCTX-M-14 and blaCTX-M-15 genes. Analysis of a total of 51 hybrid enzymes showed that enzymatic activity could be maintained in most cases, yet the enzymatically active hybrids were found to possess much fewer amino acid substitutions than the few hybrids that became inactive, suggesting that point mutations in the constructs rather than reshuffling of the fragments of the two target genes would more likely cause disruption of CTX-M activity. Certain important residues that played important functional roles in mediating enzyme activity were identified. These findings suggest that DNA shuffling is an effective ...
[摘要] 我们最近研究了通过对CTX-M-14和EMX-M-14的片段进行DNA改组来驱动CTX-M型β-内酰胺酶进化的分子事件， bla CTX-M-15基因。 总共51种杂合酶的分析显示酶活性在大多数情况下可以保持，但是酶活性杂合体被发现比少数杂交体具有少得多的氨基酸取代，这表明构建体中的点突变而不是 两个靶基因片段的重新洗牌将更可能导致CTX-M活性的破坏。 确定了一些在介导酶活性中起重要作用的重要残基。 这些发现表明，DNA改组是一种有效的方法来鉴定和表征细菌蛋白质中的重要功能结构域。
【背景】DNA重组是一种自然过程，通过该过程，细菌之间交换遗传物质以增强环境压力下的生存适应性。几种杂交CTX-M-内酰胺酶（CTX-M-64，CTX-M-123，CTX-M-137和CTX-M-132）可能是由bla CTX-M-14和 bla CTX-M-15基因是世界上最常见的变异体，近年来已有报道（Nagano et al。 ，2009; Tian et al。，2014; He et al。，2015; Liu et。， 2015年）。在这些杂合酶中，包含CTX-M-15的N-和C-末端部分和CTX-M-14的中间片段的CTX-M-64显示出比其亲本原型更高的催化活性（He <等）。，2015）。
DNA改组是一种分子途径，被设计为通过PCR介导的两种靶基因的随机组合来模拟和加速进化过程（Crameri ...
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| Design of Hybrid RNA Polymerase III Promoters for Efficient CRISPR-Cas9 Function
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] The discovery of the CRISPR-Cas9 system from Streptococcus pyogenes has allowed the development of genome engineering tools in a variety of organisms. A frequent limitation in CRISPR-Cas9 function is adequate expression levels of sgRNA. This protocol provides a strategy to construct hybrid RNA polymerase III (Pol III) promoters that facilitate high expression of sgRNA and improved CRISPR-Cas9 function. We provide selection criteria of Pol III promoters, efficient promoter construction methods, and a sample screening technique to test the efficiency of the hybrid promoters. A hybrid promoter system developed for Yarrowia lipolytica will serve as a model.
[摘要] 来自化脓性链球菌的CRISPR-Cas9系统的发现使得在各种生物体中开发基因组工程工具成为可能。 CRISPR-Cas9功能的频繁限制是足够的sgRNA表达水平。 该协议提供了构建杂合RNA聚合酶III（Pol III）启动子的策略，其促进sgRNA的高表达和改善的CRISPR-Cas9功能。 我们提供Pol III启动子的选择标准，有效的启动子构建方法以及样品筛选技术来检测杂合启动子的效率。 为解脂耶氏酵母开发的杂交启动子系统将用作模型。
【背景】CRISPR（成簇定期间隔短回文重复序列）是细菌中发现的DNA序列的集合，其中含有先前曝光的病毒DNA片段（Marraffini和Sontheimer，2010）。片段被称为间隔区DNA，并且它们侧面是短的，重复的回文序列。细菌使用这些存储的间隔序列作为模板来表达RNA，以识别和攻击再次暴露的特定病毒。当与CRISPR相关（Cas）蛋白结合时，CRISPR-Cas系统可以识别和切割外源DNA或RNA，破坏病毒并保护宿主免受重复感染（Barrangou，2013）。
一种特定的CRISPR系统，来自化脓链球菌的II型CRISPR-Cas9已经被修改成用于基因组编辑的更简单的系统。利用这个系统，研究人员能够设计特定的单引导RNA（sgRNA）序列，它与具有上游原型间隔区相邻基序（PAM;'NGG'）的目的基因的20bp序列互补（Jinek ...
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