| Generating Loss-of-function iPSC Lines with Combined CRISPR Indel Formation and Reprogramming from Human Fibroblasts
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] For both disease and basic science research, loss-of-function (LOF) mutations are vitally important. Herein, we provide a simple stream-lined protocol for generating LOF iPSC lines that circumvents the technical challenges of traditional gene-editing and cloning of established iPSC lines by combining the introduction of the CRISPR vector concurrently with episomal reprogramming plasmids into fibroblasts. Our experiments have produced nearly even numbers of all 3 genotypes in autosomal genes. In addition, we provide a detailed approach for maintaining and genotyping 96-well plates of iPSC clones.
[摘要] 对于疾病和基础科学研究而言，功能丧失（LOF）突变是非常重要的。 在这里，我们提供了一个简单的流线化协议来产生LOF iPSC系列，通过将CRISPR载体与附加型重编程质粒同时引入成纤维细胞，规避了传统基因编辑和已建立的iPSC系的克隆的技术挑战。 我们的实验已经产生了常染色体基因中所有3种基因型的几乎偶数。 此外，我们提供了一个详细的方法来维护和iPSC克隆的96孔板的基因分型。
【背景】CRISPR / Cas9技术允许简单且特异地针对特定基因组位置进行基因编辑。将该技术与诱导性多能干细胞（iPSC）的疾病建模和再生医学潜力相结合将继续对生物医学研究产生前所未有的影响。然而，使CRISPR / Cas9系统适应iPSC已经提出了几个挑战。在细胞系中进行基因编辑的传统方法是用表达Cas9蛋白质的质粒和指导RNA（gRNA）转染细胞，然后产生单克隆并筛选所需的遗传改变。不幸的是，iPSC不适用于单细胞克隆。已经开发了几种补充媒介和克隆方法来克服这一困难，但仍然充满昂贵的设备（低氧培养箱），困难的技术步骤（FACS分选的单个iPSC的存活）或劳动密集型方案（亚克隆）（Forsyth ，2006; Miyaoka ...
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| Single Genome Sequencing of Expressed and Proviral HIV-1 Envelope Glycoprotein 120 (gp120) and nef Genes
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Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] The current study provides detailed protocols utilized to amplify the complete HIV-1 gp120 and nef genes from single copies of expressed or integrated HIV present in fresh-frozen autopsy tissues of patients who died while on combined antiretroviral therapy (cART) with no detectable plasma viral load (pVL) at death (Lamers et al., 2016a and 2016b; Rose et al., 2016). This method optimizes protocols from previous publications (Palmer et al., 2005; Norström et al., 2012; Lamers et al., 2015; 2016a and 2016b; Rife et al., 2016) to produce single distinct PCR products that can be directly sequenced and includes several cost-saving and time-efficient modifications.
[摘要] 目前的研究提供了详细的方案，用于扩增完整的HIV-1 gp120和nef基因，从单个拷贝的表达或综合的HIV存在于新鲜冷冻尸检组织中，在联合抗逆转录病毒治疗（cART）而死亡的患者中，没有可检测的血浆病毒 死亡时负荷（pVL）（Lamers等，2016a和2016b; Rose等，2016）。 该方法优化了以前的出版物（Palmer等，2005;Norström等，2012; Lamers等，2015; 2016a和2016b; Rife等，2016）的方案，以产生可以直接的单独不同的PCR产物 测序并包括若干成本节约和时间有效的修改。
【背景】三十多年前，艾滋病毒感染及其临床表现，即获得性免疫缺陷综合征（AIDS），已成为全球流行病。此后，对艾滋病病毒发病机制的认识已经出现，药物治疗的发展显着延长了患者的生命。目前的cART方案包括以几种方式抑制病毒复制的各种药物，其允许几乎完全抑制血液中发现的病毒颗粒和恢复健康的CD4 + T细胞群体（CD4 +）（Autran等人，1997 ）。然而，cART治疗患者血浆中持续存在非常低水平的艾滋病毒，即使是经过数十年治疗的患者，也表明存在一种以病毒为基础的细胞库。病毒储库包含不释放感染性病毒（即被潜在感染）的感染细胞，但可以在活化后进行，这可能在各种条件下发生（Chun等，1995和1997）。 ...
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| Whole Genome Bisulfite Sequencing and DNA Methylation Analysis from Plant Tissue
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Author:
Date:
2015-02-20
[Abstract] This protocol describes whole genome bisulfite-sequencing library preparation from plant tissue and subsequent data analysis. Allele-specific methylation analysis and genome-wide identification of differentially methylated regions are additional features of the analysis procedure.
[摘要] 该协议描述了植物组织的全基因组亚硫酸氢盐测序文库制备和随后的数据分析。 等位基因特异性甲基化分析和差异甲基化区域的全基因组鉴定是分析程序的附加特征。
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